Summary
Nous présentons ici un protocole d’extraction du venin de Trichogramma dendrolimi à l’aide d’un hôte artificiel créé avec un film de polyéthylène et une solution d’acides aminés.
Abstract
Les guêpes parasitoïdes sont un groupe diversifié d’insectes hyménoptères qui constituent des ressources inestimables pour la lutte biologique contre les ravageurs. Pour assurer un parasitisme réussi, les guêpes parasitoïdes injectent du venin dans leurs hôtes pour supprimer l’immunité de leurs hôtes, moduler le développement, le métabolisme et même le comportement des hôtes. Avec plus de 600 000 espèces estimées, la diversité des guêpes parasitoïdes dépasse celle d’autres animaux venimeux, tels que les serpents, les escargots coniques et les araignées. Le venin de guêpe parasitoïde est une source sous-explorée de molécules bioactives avec des applications potentielles dans la lutte antiparasitaire et la médecine. Cependant, la collecte du venin parasitoïde est difficile en raison de l’impossibilité d’utiliser la stimulation directe ou électrique et de la difficulté de dissection en raison de leur petite taille. Trichogramma est un genre de minuscules guêpes parasitoïdes d’œufs (~0,5 mm) qui sont largement utilisées pour la lutte biologique contre les lépidoptères ravageurs dans l’agriculture et les forêts. Nous rapportons ici une méthode d’extraction du venin de T. dendrolimi à l’aide d’hôtes artificiels. Ces hôtes artificiels sont créés avec un film de polyéthylène et des solutions d’acides aminés, puis inoculés avec des guêpes Trichogramma pour le parasitisme. Le venin a ensuite été recueilli et concentré. Cette méthode permet d’extraire de grandes quantités de venin de trichogramme tout en évitant la contamination d’autres tissus causée par la dissection, un problème courant dans les protocoles de dissection de réservoir de venin. Cette approche innovante facilite l’étude du venin de Trichogramma , ouvrant la voie à de nouvelles recherches et applications potentielles.
Introduction
Les guêpes parasitoïdes sont des insectes hyménoptères parasites qui sont des ressources importantes pour la lutte biologique1. Il existe une grande variété de guêpes parasitoïdes, avec plus de 600 000 espèces estimées2. La diversité des guêpes parasitoïdes dépasse de loin celle d’autres arthropodes venimeux, tels que les serpents, les escargots coniques, les araignées, les scorpions et les abeilles. Le venin est un facteur parasitaire important chez les guêpes parasitoïdes. Pour un parasitisme réussi, le venin est injecté dans l’hôte, modulant le comportement, l’immunité, le développement et le métabolisme de l’hôte3. De plus, le venin des guêpes parasitoïdes présente une diversité remarquable dans ses structures moléculaires, ses cibles et ses fonctions, reflétant une coévolution complexe avec leurs hôtes. Ainsi, le venin parasitoïde est une ressource précieuse et sous-estimée de molécules actives à des fins insecticides ou médicales4. Contrairement au venin des serpents, des escargots coniques, des araignées, des scorpions et des abeilles, le venin de guêpe parasitoïde ne peut pas être collecté par stimulation directe ou par stimulation électrique5. La méthode actuelle d’extraction du venin de guêpe parasitoïde consiste à disséquer le réservoir de venin. Cependant, les guêpes parasitoïdes sont souvent petites, et la dissection des guêpes parasitoïdes nécessite des compétences techniques élevées. Par conséquent, si nous pouvons trouver un moyen de collecter le venin des guêpes parasitoïdes de manière efficace et pratique, il sera d’une grande aide de rechercher le venin des guêpes parasitoïdes.
Trichogramma (Hymenoptera : Trichogrammatidae) est un genre de guêpes parasitoïdes minuscules (~0,5 mm de long)6. Ces guêpes sont parmi les agents de lutte biologique les plus utilisés, ciblant particulièrement les œufs de divers lépidoptères ravageurs dans l’agriculture et les forêts. Par exemple, T. dendrolimi, l’une des espèces de trichogrammes les plus utilisées en Chine, a été largement utilisé pour lutter contre une variété de ravageurs agricoles et forestiers, tels que Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis et Chilo suppressalis. Des études antérieures ont montré que les guêpes trichogrammes pouvaient injecter leurs œufs dans des hôtes artificiels7. Les hôtes artificiels peuvent être créés à l’aide de matériaux tels que la cire8, l’agar9, le parafilm10 et le film plastique11. La solution dans les hôtes artificiels qui induit une ponte suffisante pour les trichogrammes peut être simple, comme les acides aminés ou les sels inorganiques12. Sur la base de la caractéristique selon laquelle T. dendrolimi peut parasiter des hôtes artificiels, cette étude fournit une nouvelle méthode pour extraire le venin des guêpes parasitoïdes à l’aide d’hôtes artificiels. Cette approche vise à remédier aux lacunes du faible rendement, de la faible pureté et de la sensibilité à la contamination dans les techniques d’extraction actuelles. En utilisant cette méthode, une grande quantité de venin de haute pureté de T. dendrolimi peut être extraite, ce qui répond aux besoins de la recherche scientifique et du criblage de molécules bioactives à des fins insecticides ou médicales.
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Protocol
1. L’élevage d’insectes
- Nourrissez Corcyra cephalonica avec de la farine de maïs à une température de 26 ± 1 °C et à une humidité relative de 40 % ± 10 %.
- Élevez la souche T. dendrolimi de l’insectarium Jilin à l’intérieur en utilisant les œufs de Corcyra cephalonica comme hôtes. Nourrir les guêpes adultes avec 10 % d’eau de saccharose dans des tubes de drosophile à une température de 26 ± 1 °C, une humidité relative de 70 % ± 10 %, une lumière (L) : sombre (D) une période de 14 h : 10 h.
2. Préparation de cartes d’oeufs en film plastique polyéthylène
- Prenez un film plastique polyéthylène d’une longueur de 16 cm, d’une largeur de 12 cm et d’une épaisseur de 20 μm. Presser 30 protubérances semi-circulaires d’un diamètre de 2-3 mm et d’une hauteur d’environ 3 mm à l’aide d’une tige de meulage en verre selon la disposition standard de la plaque PCR de 96 trous.
REMARQUE : Le processus d’extraction de 30 protubérances semi-circulaires à l’aide d’une tige de broyage en verre doit être effectué en faisant attention à la pression car une presse trop dure percera le plastique et contaminera la tige de broyage sans venin extraite. - Désinfectez le film plastique de polyéthylène pressé en exposant les deux côtés à la lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h.
- Ajoutez une petite quantité d’alcool polyvinylique à 10 % sur la surface semi-circulaire.
3. Parasitisme de Trichogramma dendrolimi
- Après l’anesthésie au CO2 , placez les guêpes femelles T. dendrolimi dans une boîte de collecte, et le nombre de guêpes était de ~3000.
- Placez le côté convexe de la carte d’œuf en film vers la boîte de collecte et fixez les bords avec un élastique.
- Ajouter 4 μL de solution d’acides aminés (6 g/L de leucine, 4 g/L de phénylalanine, 4,25 g/L d’histidine) à chaque saillie semi-circulaire. Recouvrez-le d’un film plastique plat en polyéthylène de 16 cm de long et 12 cm de large. Utilisez un élastique pour recouvrir hermétiquement la boîte de collecte de deux feuilles de plastique.
- Laissez les guêpes T. dendrolimi parasiter librement pendant 4 à 8 h et fournissez 10 % d’eau de saccharose à travers le coton mouillé.
4. Collecte du venin de T. dendrolimi
- Prélever la solution d’acides aminés parasités à partir de la saillie interne de la carte d’ovule artificiel et la transférer dans le bouchon des tubes de 1,5 ml.
- Couvrez le bouchon du tube avec un filet en nylon de 10 μm avec un diamètre de 25 mm, fixez fermement le filet en nylon et le tube à centrifuger. Placez le tube de centrifugation à la verticale pour une centrifugation courte à l’aide d’une mini-centrifugeuse (1360 x g) pendant 10 s et collectez la solution filtrée (~100 μL de venin de T. dendrolimi ).
- Mesurer la concentration de venin de T. dendrolimi recueilli à l’aide d’une trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) (Table des matériaux).
- Conservez le venin à -80 °C pour d’autres analyses.
5. Analyses SDS-PAGE
- Ajouter 30 μL de venin de T. dendrolimi à 10 μL de tampon de chargement d’échantillon 4x dodécyl sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) (Table des matériaux) et chauffer à 95 °C pendant 10 min.
- Effectuer un cycle de gel SDS-PAGE à 130 V pendant 120 min.
- Teindre et décolorer le gel SDS-PAGE à l’aide de l’appareil de coloration des protéines (Table des matériaux).
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Representative Results
La concentration en protéines d’échantillons représentatifs de venin a été mesurée à l’aide de la trousse d’analyse des protéines, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. Les résultats ont montré que la concentration de protéine de venin recueillie par cette méthode variait de 0,35 μg/μL à 0,46 μg/μL, tandis que le témoin négatif de la solution d’acides aminés n’avait qu’une concentration en protéines de 0,03 μg/μL à 0,05 μg/μL. La concentration de protéine de venin collectée par cette méthode est beaucoup plus élevée que celle du contrôle négatif, ce qui montre que cette méthode peut bien collecter le venin des guêpes parasites. De plus, il n’y a pas de corrélation spécifique entre le temps de parasitisme et la concentration, car différents lots de guêpes parasites peuvent avoir une vitalité différente.
De plus, le venin de T. dendrolimi a été analysé par SDS-PAGE, révélant une gamme de protéines de venin allant de moins de 10 kDa à plus de 130 kDa dans la figure 1. Cependant, lorsque le contrôle négatif de l’acide aminé a été analysé par SDS-PAGE, il a été constaté qu’il n’y avait pas de protéine à l’intérieur (Figure supplémentaire 1), ce qui a également prouvé que la protéine collectée par cette méthode était bien la protéine de venin des guêpes parasites.
Figure 1 : Analyse SDS-PAGE de la protéine du venin de T. dendrolimi. Voies 1 et 2 : les quantités chargées de protéines de venin étaient respectivement de 8 μg et 10 μg. M : Marqueur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Échantillon | Temps de parasitisme (h) | Concentration (μg/μL) | |
| Venin | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Contrôle | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tableau 1 : Information sur la concentration du venin et le témoin. La concentration en protéines d’échantillons représentatifs de venin et de contrôle a été mesurée à l’aide du kit de dosage des protéines BCA. Contrôle : les contrôles non parasités. NP : pas de parasitisme
Figure supplémentaire 1 : Analyse SDS-PAGE du témoin et du venin. Contrôle : le contrôle non parasité. Venin : les quantités chargées de protéines de venin étaient de 10 μg. M : Marqueur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous présentons ici une méthode d’extraction du venin de T. dendrolimi à l’aide d’hôtes artificiels. Les points clés de l’expérience de collecte de venin sont les suivants. (1) Au cours de la préparation, T. dendrolimi doit être anesthésié rapidement avec une concentration appropriée de CO2. Si la concentration de CO2 est trop faible, elle sera insuffisante pour anesthésier rapidement les trichogrammes . À l’inverse, si la concentration est trop élevée, les trichogrammes peuvent mourir, ce qui réduit leur capacité à parasiter l’hôte artificiel. (2) La stérilité de la solution d’acides aminés doit être assurée, car la contamination de la solution d’acides aminés peut avoir un impact négatif sur l’efficacité du parasitisme. (3) Le parasitage des cartes d’œufs artificiels doit être effectué dans des conditions d’obscurité pour favoriser le parasitisme. (4) Il est recommandé d’effectuer directement des expériences en aval ou de congeler les échantillons pour assurer l’activité du venin et éviter sa dégradation.
Il est recommandé de juger du parasitage en visualisant les œufs déposés. Si les œufs déposés ne sont pas observés au microscope, il se peut qu’aucun venin n’ait été extrait. La limite de la technique est qu’elle nécessite un grand nombre de guêpes parasitoïdes. Une seule extraction de venin nécessite environ 3 000 guêpes parasitoïdes, ce qui augmente la charge de travail.
La méthode précédente d’extraction du venin de guêpe parasitoïde consistait à disséquer le réservoir de venin. Cependant, les guêpes parasitoïdes sont minuscules ; par exemple, les trichogrammes mesurent moins de 1 mm de long. Non seulement les exigences techniques de la dissection des réservoirs de venin sont élevées, mais la contamination d’autres tissus pendant la dissection est également courante. La nouvelle méthode utilisant des hôtes artificiels peut améliorer l’efficacité de l’extraction du venin et éviter la contamination par d’autres tissus causée par la dissection.
Cette méthode peut également être étendue à d’autres guêpes parasitoïdes. Par exemple, des ovocytes en film plastique de polyéthylène contenant un mélange d’ions sel et d’acides aminés peuvent être utilisés pour obtenir du venin de T. neustadt, et des œufs de cire artificielle contenant une solution de KCl-MgSO4 peuvent être utilisés pour obtenir du venin de T. pretiosum. En plus des trichogrammes, il a été rapporté que l’Anastatus japonicus13, le Microplitis croceipes9 et l’Habrobracon hebetor10 peuvent parasiter des hôtes artificiels. En utilisant les propriétés de ces guêpes parasitoïdes pour parasiter des hôtes artificiels, des méthodes similaires d’extraction du venin peuvent être développées.
Le venin de guêpe parasitoïde est une source sous-explorée de molécules biologiques ayant des applications potentielles de lutte antiparasitaire et médicales. Récemment, les utilisations potentielles du venin parasitoïde en pharmacologie et en agriculture ont été reconnues14,15. D’un point de vue pharmacologique, de nombreux composants du venin parasitoïde ont de larges perspectives d’application potentielles dans l’optimisation de l’immunothérapie, le traitement des troubles thrombotiques et la recherche de modèles pour de nouveaux antibiotiques. En agriculture, certains composants du venin parasitoïde peuvent être utilisés comme agents de lutte biologique pour réguler le développement, la reproduction et l’immunité des ravageurs afin d’atteindre l’objectif de lutte efficace contre les ravageurs15. Cependant, le manque de méthodes efficaces d’extraction du venin limite souvent la recherche sur le venin des guêpes parasitoïdes, en particulier les minuscules guêpes parasitoïdes telles que les trichogrammes. Cet article fournit une méthode efficace pour extraire le venin de Trichogramma, qui fournit une méthode pour l’étude de suivi du venin de Trichogramma, telle que l’identification de la composition protéique et de la fonction du venin. En outre, cette méthode peut également être utilisée comme référence pour d’autres recherches sur le venin de guêpe parasitoïde et fournit un soutien pour promouvoir le criblage de molécules bioactives à partir de venins parasitoïdes pour des applications insecticides ou médicales.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer et n’a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le soutien financier de la Fondation des sciences naturelles de la province de Hainan (subvention n° 323QN262), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31701843 et 32172483), du Fonds d’innovation pour la science et la technologie agricoles du Jiangsu (subvention n° 323QN262). CX(22)3012 et CX(21)3008), la Fondation « Shuangchuang Doctor » de la province du Jiangsu (subvention n° 202030472) et le fonds de démarrage de l’Université agricole de Nanjing (subvention n° 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
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