Summary
Her præsenterer vi en protokol til ekstraktion af gift fra Trichogramma dendrolimi ved anvendelse af en kunstig vært skabt med polyethylenfilm og aminosyreopløsning.
Abstract
Parasitoide hveps er en forskelligartet gruppe af hymenopteranske insekter, der tjener som uvurderlige ressourcer til skadedyrsbekæmpelse. For at sikre vellykket parasitisme injicerer parasitoide hvepse gift i deres værter for at undertrykke deres værts immunitet, modulere værternes udvikling, stofskifte og endda adfærd. Med over 600.000 anslåede arter overgår mangfoldigheden af parasitoide hvepse andre giftige dyr, såsom slanger, keglesnegle og edderkopper. Parasitoid hvepsegift er en underudforsket kilde til bioaktive molekyler med potentielle anvendelser inden for skadedyrsbekæmpelse og medicin. Imidlertid er indsamling af parasitoid gift udfordrende på grund af manglende evne til at bruge direkte eller elektrisk stimulering og vanskeligheden ved dissektion på grund af deres lille størrelse. Trichogramma er en slægt af små (~ 0,5 mm) æg parasitoide hveps, der i vid udstrækning anvendes til biologisk bekæmpelse af lepidopteran skadedyr i både landbrug og skove. Her rapporterer vi en metode til ekstraktion af gift fra T. dendrolimi ved hjælp af kunstige værter. Disse kunstige værter er skabt med polyethylenfilm og aminosyreopløsninger og derefter inokuleret med Trichogramma-hveps til parasitisme. Giften blev efterfølgende opsamlet og koncentreret. Denne metode muliggør ekstraktion af store mængder Trichogramma-gift , samtidig med at man undgår forurening fra andre væv forårsaget af dissektion, et almindeligt problem i giftreservoirdissektionsprotokoller. Denne innovative tilgang letter undersøgelsen af Trichogramma-gift og baner vejen for ny forskning og potentielle anvendelser.
Introduction
Parasitoide hveps er parasitære hymenopteranske insekter, der er vigtige ressourcer til biologisk bekæmpelse1. Der er en bred vifte af parasitoide hvepse, med over 600.000 anslåede arter2. Mangfoldigheden af parasitoide hveps overstiger langt andre giftige leddyr, såsom slanger, keglesnegle, edderkopper, skorpioner og bier. Gift er en vigtig parasitisk faktor i parasitoide hveps. For vellykket parasitisme injiceres gift i værten, modulerer værtsens adfærd, immunitet, udvikling og metabolisme3. Desuden viser giften fra parasitoide hvepse bemærkelsesværdig mangfoldighed i sine molekylære strukturer, mål og funktioner, hvilket afspejler kompleks coevolution med deres værter. Således er parasitoidgift en værdifuld og undervurderet ressource af aktive molekyler til insekticide eller medicinske formål4. I modsætning til gift fra slanger, keglesnegle, edderkopper, skorpioner og bier kan parasitoid hvepsegift ikke indsamles ved direkte stimulering eller elektrisk stimulering5. Den nuværende metode til udvinding af parasitoid hvepsegift er at dissekere giftreservoiret. Imidlertid er parasitoide hveps ofte små, og dissektion af parasitoide hveps kræver høje tekniske færdigheder. Derfor, hvis vi kan finde en måde at indsamle giften fra parasitoide hveps effektivt og bekvemt, vil det være til stor hjælp at undersøge giften fra parasitoide hveps.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) er en slægt af små (~ 0,5 mm lange) parasitoide hveps6. Disse hvepse er blandt de mest anvendte biokontrolmidler, især rettet mod æg fra forskellige lepidopteran skadedyr i både landbrug og skove. For eksempel er T. dendrolimi, en af de mest anvendte Trichogramma-arter i Kina, blevet anvendt i vid udstrækning til bekæmpelse af en række landbrugs- og skovbrugsskadedyr, såsom Dendrolimus superans, Ostrinia furnacialis og Chilo suppressalis. Tidligere undersøgelser viste, at Trichogramma-hvepse kunne injicere deres æg i kunstige værter7. Kunstige værter kan oprettes ved hjælp af materialer som voks8, agar9, Parafilm10 og plastfilm11. Opløsningen i kunstige værter, der inducerer tilstrækkelig oviposition til Trichogramma , kan være enkel, såsom aminosyrer eller uorganiske salte12. Baseret på den egenskab, at T. dendrolimi kan parasitere kunstige værter, giver denne undersøgelse en ny metode til ekstraktion af gift fra parasitoide hveps ved hjælp af kunstige værter. Denne tilgang sigter mod at afhjælpe manglerne ved lavt udbytte, lav renhed og modtagelighed for forurening i nuværende ekstraktionsteknikker. Ved anvendelse af denne metode kan en stor mængde gift med høj renhed fra T. dendrolimi ekstraheres, hvilket opfylder behovene for videnskabelig forskning og screening af bioaktive molekyler til insekticide eller medicinske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektopdræt
- Foder Corcyra cephalonica på majsmel ved en temperatur på 26 ± 1 ° C og en relativ luftfugtighed på 40% ± 10%.
- Ras T. dendrolimi stamme fra Jilin insekt indendørs ved hjælp af æg af Corcyra cephalonica som værter. Foder hveps voksne 10% saccharose vand i Drosophila rør ved en temperatur på 26 ± 1 ° C, relativ luftfugtighed på 70% ± 10%, lys (L): mørk (D) periode på 14 timer: 10 timer.
2. Fremstilling af æggekort af polyethylenplastfilm
- Tag en polyethylenplastfilm med en længde på 16 cm, en bredde på 12 cm og en tykkelse på 20 μm. Tryk 30 halvcirkelformede fremspring med en diameter på 2-3 mm og en højde på ca. 3 mm ud ved hjælp af en glasslibnestang i henhold til standard PCR-pladelayoutet på 96 huller.
BEMÆRK: Processen med at presse 30 halvcirkelformede fremspring ud ved hjælp af en glasslibnestang skal udføres under hensyntagen til trykket, fordi en for hård presse vil punktere plasten og forurene den ekstraherede giftfri slibestang. - Desinficer den pressede polyethylenplastfilm ved at udsætte begge sider for ultraviolet (UV) lys i 1 time.
- Tilsæt en lille mængde 10% polyvinylalkohol til den halvcirkelformede overflade.
3. Trichogramma dendrolimi parasitisme
- Efter CO2 anæstesi placeres T. dendrolimi kvindelige hveps i en opsamlingsboks, og antallet af hveps var ~ 3000.
- Placer den konvekse side af filmægkortet mod opsamlingsboksen, og fastgør kanterne med et gummibånd.
- Der tilsættes 4 μL aminosyreopløsning (6 g/l leucin, 4 g/l phenylalanin, 4,25 g/l histidin) til hvert halvcirkelformet fremspring. Dæk den med en flad polyethylenplastfilm 16 cm lang og 12 cm bred. Brug et gummibånd til tæt at dække opsamlingsboksen med to ark plast.
- Lad T. dendrolimi hveps parasitere frit i 4-8 timer og give 10% saccharose vand gennem fugtet bomuld.
4. Indsamling af T. dendrolimi gift
- Få den parasiterede aminosyreopløsning fra det indre fremspring af det kunstige ægkort og overfør det til hætten på 1,5 ml rør.
- Dæk rørhætten med et 10 μm nylonnet med en diameter på 25 mm, fastgør nylonnettet og centrifugerøret tæt. Centrifugeglasset anbringes lodret til kort centrifugering ved hjælp af en minicentrifuge (1360 x g) i 10 s, og den filtrerede opløsning (~100 μL T. dendrolimi gift) opsamles.
- Mål koncentrationen af opsamlet T. dendrolimi gift ved hjælp af et Bicinchoninsyre (BCA) assay kit (Table of Materials).
- Giften opbevares ved -80 °C til yderligere analyser.
5. SDS-PAGE analyser
- Der tilsættes 30 μL T. dendrolimi gift til 10 μL 4x natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) prøvepåfyldningsbuffer (materialetabel) og opvarmes ved 95 °C i 10 minutter.
- Udfør SDS-PAGE gelkørsel ved 130 V i 120 min.
- Plet og affarvning af SDS-PAGE-gelen ved hjælp af proteinfarvningsapparatet (Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteinkoncentrationen i repræsentative giftprøver blev målt ved hjælp af proteinanalysesættet med resultaterne vist i tabel 1. Resultaterne viste, at koncentrationen af giftprotein indsamlet ved denne metode varierede fra 0,35 μg/μL til 0,46 μg/μL, mens den negative kontrol af aminosyreopløsningen kun havde en proteinkoncentration på 0,03 μg/μL til 0,05 μg/μL. Koncentrationen af giftprotein indsamlet ved denne metode er meget højere end for negativ kontrol, hvilket viser, at denne metode kan samle giften fra parasitære hveps godt. Derudover er der ingen specifik sammenhæng mellem parasitismetid og koncentration, fordi forskellige partier af parasitiske hvepse kan have forskellig vitalitet.
Derudover blev T. dendrolimi gift analyseret af SDS-PAGE, der afslørede et giftproteinområde, der spænder fra under 10 kDa til over 130 kDa i figur 1. Men da den negative kontrol af aminosyre blev analyseret af SDS-PAGE, blev det konstateret, at der ikke var noget protein i det (supplerende figur 1), hvilket også viste, at proteinet indsamlet ved denne metode faktisk var giftproteinet fra parasitære hveps.
Figur 1: SDS-PAGE analyse af T. dendrolimi gift protein. Bane 1-2: De fyldte mængder giftprotein var henholdsvis 8 μg og 10 μg. M: Markør. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Prøve | Parasitisme tid (h) | Koncentration (μg/μL) | |
| Gift | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Kontrol | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabel 1: Koncentrationsoplysninger for giften og kontrollen. Proteinkoncentrationen af repræsentativ gift og kontrolprøver blev målt ved hjælp af BCA-proteinanalysesættet. Kontrol: de ikke-parasiterede kontroller. NP: ingen parasitisme
Supplerende figur 1: SDS-PAGE analyse af kontrol og gift. Kontrol: den ikke-parasiterede kontrol. Gift: de indlæste mængder giftprotein var 10 μg. M: Markør. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en metode til ekstraktion af gift fra T. dendrolimi ved hjælp af kunstige værter. Nøglepunkterne i giftopsamlingseksperimentet er som følger. (1) Under tilberedningen skal T. dendrolimi bedøves hurtigt med en passende CO2 -koncentration. Hvis CO2 -koncentrationen er for lav, vil det være utilstrækkeligt at bedøve Trichogramma hurtigt. Omvendt, hvis koncentrationen er for høj, kan Trichogramma dø, hvilket reducerer deres evne til at parasitere den kunstige vært. (2) Aminosyreopløsningens sterilitet skal sikres, da kontaminering af aminosyreopløsningen kan påvirke parasitismens effektivitet negativt. (3) Parasitering af kunstige ægkort bør udføres under mørke forhold for at fremme parasitisme. (4) Det anbefales enten at udføre downstream-forsøg direkte eller fryse prøverne for at sikre giftens aktivitet og forhindre nedbrydning.
Det anbefales at bedømme parasitering ved at visualisere deponerede æg. Hvis de deponerede æg ikke observeres under mikroskopet, kan der ikke være ekstraheret gift. Begrænsningen af teknikken er, at den kræver et stort antal parasitoide hveps. En enkelt giftekstraktion kræver ca. 3.000 parasitoide hvepse, hvilket øger arbejdsbyrden.
Den tidligere metode til udvinding af parasitoid hvepsegift var at dissekere giftreservoiret. Imidlertid er parasitoide hvepse små; for eksempel er Trichogramma mindre end 1 mm lang. Ikke alene er de tekniske krav til dissekering af giftreservoirer høje, men forurening af andre væv under dissektion er også almindelig. Den nye metode, der bruger kunstige værter, kan forbedre effektiviteten af giftekstraktion og undgå forurening fra andre væv forårsaget af dissektion.
Denne metode kan også udvides til andre parasitoide hveps. For eksempel kan polyethylenplastfilmoocytter indeholdende en blanding af saltioner og aminosyrer anvendes til opnåelse af T. neustadt-gift, og kunstige voksæg indeholdende KCl-MgSO4-opløsning kan anvendes til opnåelse af T. pretiosum-gift. Ud over Trichogramma er det blevet rapporteret, at Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 og Habrobracon hebetor10 kan parasitere kunstige værter. Ved hjælp af egenskaberne af disse parasitoide hveps til at parasitere kunstige værter kan lignende giftekstraktionsmetoder udvikles.
Parasitoid hvepsegift er en underudforsket kilde til biologiske molekyler med potentiel skadedyrsbekæmpelse og medicinske anvendelser. For nylig er de potentielle anvendelser af parasitoid gift i farmakologi og landbrug blevet anerkendt14,15. Farmakologisk set har mange komponenter i parasitoid gift brede potentielle anvendelsesmuligheder til optimering af immunterapi, behandling af trombotiske lidelser og finde skabeloner til nye antibiotika. I landbruget kan nogle komponenter i parasitoid gift anvendes som biologiske bekæmpelsesmidler til at regulere udvikling, reproduktion og immunitet af skadedyr for at nå formålet med effektivt at bekæmpe skadedyr15. Imidlertid begrænser manglen på effektive giftekstraktionsmetoder ofte forskning i giften fra parasitoide hvepse, især små parasitoide hvepse som Trichogramma. Dette papir giver en effektiv metode til at ekstrahere giften fra Trichogramma, som giver en metode til opfølgningsundersøgelse af Trichogramma-gift, såsom identifikation af proteinsammensætning og giftfunktion. Derudover kan denne metode også bruges som reference for anden parasitoid hvepsegiftforskning og yder støtte til fremme af screening af bioaktive molekyler fra parasitoide gifte til insekticide eller medicinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre og ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender økonomisk støtte fra Natural Science Foundation of Hainan Province (bevilling nr. 323QN262), National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 31701843 og 32172483), Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (bevilling nr. CX (22) 3012 og CX (21) 3008), "Shuangchuang Doctor" Foundation of Jiangsu Province (Grant No. 202030472) og Nanjing Agricultural University startup fund (Grant No. 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
