Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att extrahera gift från Trichogramma dendrolimi med hjälp av en konstgjord värd skapad med polyetenfilm och aminosyralösning.
Abstract
Parasitsteklar är en mångsidig grupp av steklarinsekter som fungerar som ovärderliga resurser för biologisk bekämpning av skadedjur. För att säkerställa framgångsrik parasitism injicerar parasitoidsteklar gift i sina värdar för att undertrycka sina värdars immunitet, modulera värdarnas utveckling, ämnesomsättning och till och med beteende. Med över 600 000 uppskattade arter överträffar mångfalden av parasitoidsteklar den hos andra giftiga djur, såsom ormar, kottsniglar och spindlar. Parasitoid getinggift är en underutforskad källa till bioaktiva molekyler med potentiella tillämpningar inom skadedjursbekämpning och medicin. Att samla in parasitoidgift är dock utmanande på grund av oförmågan att använda direkt eller elektrisk stimulering och svårigheten att dissektionera på grund av deras ringa storlek. Trichogramma är ett släkte av små (~0,5 mm) äggparasitsteklar som används i stor utsträckning för biologisk bekämpning av fjärilsskadegörare i både jordbruk och skog. Här redovisar vi en metod för att extrahera gift från T. dendrolimi med hjälp av artificiella värdar. Dessa artificiella värdar skapas med polyetenfilm och aminosyralösningar och inokuleras sedan med Trichogramma-getingar för parasitism. Giftet samlades därefter in och koncentrerades. Denna metod gör det möjligt att extrahera stora mängder Trichogramma-gift samtidigt som man undviker kontaminering från andra vävnader orsakade av dissektion, ett vanligt problem i dissektionsprotokoll för giftreservoarer. Detta innovativa tillvägagångssätt underlättar studier av Trichogramma-gift , vilket banar väg för ny forskning och potentiella tillämpningar.
Introduction
Parasitsteklar är parasitiska steklar som är viktiga resurser för biologisk bekämpning1. Det finns en mängd olika parasitsteklar, med över 600 000 uppskattade arter2. Mångfalden av parasitoida steklar överstiger vida den hos andra giftiga leddjur, såsom ormar, kottsniglar, spindlar, skorpioner och bin. Gift är en viktig parasitfaktor hos parasitsteklar. För framgångsrik parasitism injiceras gift i värden, vilket modulerar värdens beteende, immunitet, utveckling och ämnesomsättning3. Dessutom uppvisar giftet från parasitoida steklar en anmärkningsvärd mångfald i sina molekylära strukturer, mål och funktioner, vilket återspeglar komplex samevolution med deras värdar. Således är parasitoidgift en värdefull och underskattad resurs av aktiva molekyler för insekticida eller medicinska ändamål4. Till skillnad från giftet från ormar, kottsniglar, spindlar, skorpioner och bin kan parasitoid getinggift inte samlas in genom direkt stimulering eller elektrisk stimulering5. Den nuvarande metoden för extraktion av parasitoid getinggift är att dissekera giftreservoaren. Parasitsteklar är dock ofta små, och dissektion av parasitsteklar kräver hög teknisk kompetens. Därför, om vi kan hitta ett sätt att samla in giftet från parasitoidsteklar effektivt och bekvämt, kommer det att vara till stor hjälp att undersöka giftet från parasitoidsteklar.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) är ett släkte av små (~0,5 mm långa) parasitsteklar6. Dessa getingar är bland de mest använda biologiska bekämpningsmedlen och riktar sig särskilt mot ägg från olika fjärilsskadegörare i både jordbruk och skog. Till exempel har T. dendrolimi, en av de mest använda Trichogramma-arterna i Kina, använts i stor utsträckning för att bekämpa en mängd olika skadegörare inom jord- och skogsbruk, såsom Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis och Chilo suppressalis. Tidigare studier har visat att Trichogramma-getingar kan injicera sina ägg i artificiella värdar7. Konstgjorda värdar kan skapas med hjälp av material som vax8, agar9, Parafilm10 och plastfilm11. Lösningen i artificiella värdar som inducerar tillräcklig äggläggning för Trichogramma kan vara enkel, såsom aminosyror eller oorganiska salter12. Baserat på egenskapen att T. dendrolimi kan parasitera artificiella värdar, ger denna studie en ny metod för att extrahera gift från parasitoida getingar med hjälp av konstgjorda värdar. Detta tillvägagångssätt syftar till att ta itu med bristerna med lågt utbyte, låg renhet och känslighet för kontaminering i nuvarande extraktionstekniker. Genom att använda denna metod kan en stor mängd gift med hög renhet från T. dendrolimi extraheras, vilket uppfyller behoven av vetenskaplig forskning och screening av bioaktiva molekyler för insekticida eller medicinska ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektsuppfödning
- Utfodra Corcyra cephalonica med majsmjöl vid en temperatur på 26 ± 1 °C och en relativ luftfuktighet på 40 % ± 10 %.
- Odla T. dendrolimi stam från Jilin insekt inomhus med ägg av Corcyra cephalonica som värdar. Mata vuxna getingar med 10 % sackarosvatten i Drosophila-rör vid en temperatur på 26 ± 1 °C, relativ luftfuktighet på 70 % ± 10 %, ljus (L): mörk (D) period på 14 timmar: 10 timmar.
2. Beredning av äggkort av polyetenplastfilm
- Ta en polyetenplastfilm med en längd på 16 cm, en bredd på 12 cm och en tjocklek på 20 μm. Tryck ut 30 halvcirkelformade utsprång med en diameter på 2-3 mm och en höjd på cirka 3 mm med hjälp av en glasslipstång enligt standardlayouten för PCR-plattor med 96 hål.
OBS: Processen att pressa ut 30 halvcirkelformade utsprång med hjälp av en glasslipstång måste göras med hänsyn till trycket eftersom en för hård press kommer att punktera plasten och förorena den extraherade giftfria slipstången. - Desinficera den pressade polyetenplastfilmen genom att utsätta båda sidor för ultraviolett (UV) ljus i 1 timme.
- Tillsätt en liten mängd 10 % polyvinylalkohol till den halvcirkelformade ytan.
3. Trichogramma dendrolimi parasitism
- Efter CO2 bedövning, placera T. dendrolimi hongetingar i en uppsamlingslåda, och antalet getingar var ~3000.
- Placera den konvexa sidan av filmäggkortet mot uppsamlingslådan och fäst kanterna med ett gummiband.
- Tillsätt 4 μl aminosyralösning (6 g/l leucin, 4 g/l fenylalanin, 4,25 g/l histidin) till varje halvcirkelformad utbuktning. Täck den med en platt polyetenplastfilm som är 16 cm lång och 12 cm bred. Använd ett gummiband för att täcka uppsamlingslådan ordentligt med två plastark.
- Låt T. dendrolimi getingar parasitera fritt i 4-8 timmar och ge 10% sackarosvatten genom fuktad bomull.
4. Insamling av T. dendrolimi gift
- Ta den parasitiserade aminosyralösningen från det inre utsprånget av det konstgjorda äggkortet och överför det till locket på 1,5 ml rör.
- Täck rörlocket med ett 10 μm nylonnät med en diameter på 25 mm, fäst nylonnätet och centrifugera röret ordentligt. Placera centrifugröret upprätt för kort centrifugering med en minicentrifug (1360 x g) i 10 s och samla upp den filtrerade lösningen (~100 μL T. dendrolimi gift).
- Mät koncentrationen av uppsamlat T. dendrolimi-gift med hjälp av ett analyskit för bicinkoninsyra (BCA) (Materialförteckning).
- Förvara giftet vid -80 °C för vidare analys.
5. SDS-PAGE analyser
- Tillsätt 30 μl T. dendrolimi venom till 10 μl 4x natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) provbelastningsbuffert (Materialförteckning) och värm vid 95 °C i 10 min.
- Utför SDS-PAGE gelkörning vid 130 V i 120 minuter.
- Färga och avfärga SDS-PAGE-gelen med hjälp av proteinfärgningsapparaten (Materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteinkoncentrationen i representativa giftprover mättes med hjälp av proteinanalyssatsen, med resultaten presenterade i tabell 1. Resultaten visade att koncentrationen av giftprotein som samlats in med denna metod varierade från 0,35 μg/μL till 0,46 μg/μL, medan den negativa kontrollen av aminosyralösning endast hade en proteinkoncentration på 0,03 μg/μL till 0,05 μg/μL. Koncentrationen av giftprotein som samlas in med denna metod är mycket högre än för negativ kontroll, vilket visar att denna metod kan samla in giftet från parasitsteklar väl. Dessutom finns det inget specifikt samband mellan parasitismtid och koncentration eftersom olika grupper av parasitsteklar kan ha olika vitalitet.
Dessutom analyserades T. dendrolimi gift med SDS-PAGE, vilket avslöjade ett giftproteinintervall som sträcker sig från under 10 kDa till över 130 kDa i figur 1. Men när den negativa kontrollen av aminosyran analyserades med SDS-PAGE fann man att det inte fanns något protein i den (Supplement Figure 1), vilket också bevisade att proteinet som samlades in med denna metod verkligen var giftproteinet hos parasitsteklar.
Figur 1: SDS-PAGE-analys av T. dendrolimi giftprotein. Bana 1-2: de laddade mängderna av giftprotein var 8 μg respektive 10 μg. M: Markör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Prov | Parasitism tid (h) | Koncentration (μg/μL) | |
| Gift | 1 | 5 | 0.39 |
| 2 | 6 | 0.42 | |
| 3 | 5 | 0.4 | |
| 4 | 6 | 0.35 | |
| 5 | 5 | 0.46 | |
| Kontroll | 1 | NP | 0.04 |
| 2 | NP | 0.03 | |
| 3 | NP | 0.05 | |
| 4 | NP | 0.03 | |
| 5 | NP | 0.03 | |
Tabell 1: Information om giftets koncentration och kontroll. Proteinkoncentrationen i representativa gift- och kontrollprover mättes med hjälp av BCA-proteinanalyssatsen. Kontroll: de oparasiterade kontrollerna. NP: ingen parasitism
Kompletterande figur 1: SDS-PAGE-analys av kontroll och gift. Kontroll: den oparasiterade kontrollen. Gift: de laddade mängderna av giftprotein var 10 μg. M: Markör. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metod för att extrahera gift från T. dendrolimi med hjälp av artificiella värdar. De viktigaste punkterna i giftinsamlingsexperimentet är följande. (1) Under beredningen måste T. dendrolimi bedövas snabbt med en lämplig koncentration av CO2 . Om CO2 -koncentrationen är för låg kommer det att vara otillräckligt för att bedöva trichogrammat snabbt. Omvänt, om koncentrationen är för hög, kan Trichogramma dö, vilket minskar deras förmåga att parasitera den artificiella värden. (2) Aminosyralösningens sterilitet måste säkerställas, eftersom kontaminering av aminosyralösningen kan ha en negativ inverkan på parasitismens effektivitet. (3) Parasitisering av konstgjorda äggkort bör utföras under mörka förhållanden för att främja parasitism. (4) Det rekommenderas att antingen direkt utföra nedströmsförsök eller frysa proverna för att säkerställa giftets aktivitet och förhindra nedbrytning.
Det rekommenderas att bedöma parasitisering genom att visualisera deponerade ägg. Om de deponerade äggen inte observeras i mikroskopet kan inget gift ha extraherats. Teknikens begränsning är att den kräver ett stort antal parasitsteklar. En enda giftextraktion kräver cirka 3 000 parasitsteklar, vilket ökar arbetsbelastningen.
Den tidigare metoden för extraktion av parasitoidstekelgift var att dissekera giftreservoaren. Parasitoidsteklar är dock små; Trichogramma är till exempel mindre än 1 mm långt. Det är inte bara de tekniska kraven för att dissekera giftreservoarer höga, utan det är också vanligt att andra vävnader kontamineras under dissektionen. Den nya metoden med konstgjorda värdar kan förbättra effektiviteten av giftextraktion och undvika kontaminering från andra vävnader orsakade av dissektion.
Denna metod kan också utvidgas till andra parasitsteklar. Till exempel kan oocyter av polyetenplastfilm som innehåller en blandning av saltjoner och aminosyror användas för att erhålla T. neustadt-gift, och konstgjorda vaxägg som innehåller KCl-MgSO4-lösning kan användas för att erhålla T. pretiosum-gift. Förutom Trichogramma har det rapporterats att Anastatus japonicus13, Microplitis croceipes9 och Habrobracon hebetor10 kan parasitera artificiella värdar. Genom att använda egenskaperna hos dessa parasitoidsteklar för att parasitera artificiella värdar kan liknande giftextraktionsmetoder utvecklas.
Parasitoid getinggift är en underutforskad källa till biologiska molekyler med potentiell skadedjursbekämpning och medicinska tillämpningar. Nyligen har de potentiella användningsområdena för parasitoidgift inom farmakologi och jordbruk erkänts14,15. Farmakologiskt har många komponenter i parasitoidgift breda potentiella tillämpningsmöjligheter för att optimera immunterapi, behandla trombotiska sjukdomar och hitta mallar för nya antibiotika. Inom jordbruket kan vissa komponenter i parasitoidgift användas som biologiska bekämpningsmedel för att reglera skadedjurens utveckling, reproduktion och immunitet för att uppnå syftet att effektivt bekämpa skadedjur15. Bristen på effektiva metoder för att extrahera gift begränsar dock ofta forskningen om giftet hos parasitoidsteklar, särskilt små parasitoidsteklar som Trichogramma. Denna artikel ger en effektiv metod för att extrahera giftet från Trichogramma, vilket ger en metod för uppföljningsstudier av Trichogramma-gift, såsom identifiering av proteinsammansättning och giftfunktion. Dessutom kan denna metod också användas som referens för annan parasitoid getinggiftsforskning och ger stöd för att främja screening av bioaktiva molekyler från parasitoida gifter för insekticida eller medicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja och inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner ekonomiskt stöd från Natural Science Foundation of Hainan Province (Grant No. 323QN262), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31701843 and 32172483), Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (Grant No. CX(22)3012 och CX(21)3008), "Shuangchuang Doctor"-stiftelsen i Jiangsu-provinsen (anslag nr 202030472) och Nanjing Agricultural Universitys startfond (bidrag nr 804018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
