드로소필라 멜라노가스터 난소 해부 : 전 비보 조직 준비를위한 기술

Overview

이 비디오는 Drosophila 난소의 일반적인 해부학을 설명하고 살아있는 또는 고정 된 화상 진찰을 위해 난소를 해부하는 방법을 특징으로합니다.

Protocol

이 프로토콜은 파커 외에서발췌, 드로소필라 난소에서 미토콘드리아 구조 와 기능을 공부, J. Vis. Exp. (2017).

1. 드로소필라 의 준비 (필요한 도구는 그림 1A에묘사됩니다)

1. 설명된 실험의 경우, 동백 5일 이내에 드로소필라(실온 또는 25°C)를 수집하고 5~7mL의 드로소필라 음식(재료표 참조)으로 채워진 유리병에 배치하고 각 유리병에 25파리 를 넘지 않고; 2:1의 여성 비율을 유지합니다.
2. Drosophila 계란 생산을 자극 하기 위해 과립 효 모의 소량을 뿌려. 2 - 4 일 이내에 실험 조작을 수행합니다.

2. 드로소필라 난소의 해부 (필요한 도구는 그림 1A에묘사)

1. 따뜻한 곤충 해부 매체 (재료의 표참조) 실온, 25 °C. 8웰 유리 해부 접시의 3개의 우물을 채우고, 각 우물에 200 μL의 배지를 채웁니다.
2. 유리병 플러그 아래에 블로우 건의 바늘을 배치하여 CO_2로 드로소필라를 마취시합니다. 플라이 패드에 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 5 명의 암컷을 분류하고 해부 접시의 첫 번째 우물에 놓습니다. 살아있는 현미경 검사를 수행할 때 한 번에 하나의 Drosophila를 처리하십시오.
3. 해부 현미경의 안면을 통해 보는 동안, 집게의 두 쌍을 사용하여 복부에서 흉부를 끊는다. 집게를 사용하여 복부를 접시의 두 번째 우물로 조심스럽게 옮기습니다.
4. 한 쌍의 집게를 사용하여 후반 끝에서 복부를 잡고 난소를 다른 복부 내용과 함께 천천히 밀어 넣습니다( 다른 복부 내용물과 함께) 다른 한 쌍의 집게와 함께 밀어 넣습니다. 이 시도가 실패하면 난소를 방출하기 위해 앞쪽 끝에 집게를 삽입하여 복부 외골격을 조심스럽게 제거하십시오.
5. 집게를 사용하여 불투명 후방끝(즉,노른자 채워진, 후기 단계 계란)에 의해 개별 난소를 잡고 살아있는 현미경 검사를 위해 처리하거나 면역 염색을 수행하기 위해 고정하기 위해 괴롭히는 요리의 세 번째 우물로 조심스럽게 이동합니다.
6. 조심스럽게 포셉의 쌍으로 후면 끝에 의해 유지하면서 각 난소의 전방 끝에 후면에서 가볍게 괴롭히는 바늘을 청소하여 난소 주위의 보호 칼집을 애타게.
   참고: 놀리는 동안 손상을 최소화하기 위해, 바늘 끝을 구부리고 현미경의 배율을 증가시켜 각 난소를 확대(도 1A). 놀리는 칼집을 부러 뜨릴 만큼 효과적이어야하지만, 또한 바오리올의 무결성을 보존하기 위해 신중하게 수행해야합니다.

Representative Results

그림 1: 실험 계획 및 준비. (A) 설명된 방법에 사용되는 도구: A. 플라이 바이알; B. 곤충 해부 매체; C. 파라포름알데히드; D. 플라이 브러쉬; E. 해부 접시; F. 커버 글래스; G. 마이크로퍼지 튜브. H. 유리 바닥 접시; I. 유리 슬라이드; J. 1,000-μL 마이크로파이프; K. 200-μL 마이크로파이프; L. 2.5-μL 마이크로파이프; M. 구부러진 팁으로 바늘을 괴롭히는 (팁이 확대됨); N. 두꺼운 집게; O. 얇은 집게. (B) 설명된 메서드를 나타내는 플로우 차트 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000