Drosophila melanogaster Dissezione ovarica: una tecnica per la preparazione dei tessuti ex vivo

Overview

Questo video descrive l'anatomia generale dell'ovaio di Drosophila e presenta un metodo per sezionare le ovaie per l'imaging vivo o fisso.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp.

1. Preparazione della Drosophila (gli strumenti richiesti sono raffigurati nella figura 1A)

1. Per uno qualsiasi degli esperimenti descritti, raccogliere drosophila (mantenuto a temperatura ambiente, o 25 °C) entro 5 giorni dall'eclusione e metterli in una fiala piena di 5 - 7 mL di cibo Drosophila (vedi Tabella dei materiali),con non più di 25 mosche in ogni fiala; mantenere un rapporto femmina-maschio di 2:1.
2. Cospargere una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova drosophila. Eseguire la manipolazione sperimentale entro 2 - 4 giorni.

2. Dissezione delle ovaie di Drosophila (gli strumenti richiesti sono raffigurati nella figura 1A)

1. Mezzo di sezionamento degli insetti caldi (vedi Tabella dei materiali)a temperatura ambiente, 25 °C. Riempire tre pozzi di un piatto di sezionatura in vetro a otto pozzi, con 200 μL di mezzo in ogni pozzo.
2. Anestetizzare Drosophila con CO_{2 posizionando} l'ago della pistola a soffiante sotto il tappo del flaconcino. Mettili su un fly pad. Utilizzando un microscopio sezionato, ordinare 5 femmine e posizionarle nel primo pozzo del piatto di sezionazione. Maneggia una Drosophila alla volta quando esegui la microscopia dal vivo.
3. Mentre guardi attraverso l'oculare del microscopio a dissezione, semetti il torace dall'addome usando due paia di forcette. Usando le forcep, trasferire con cura gli addome al secondo pozzo del piatto.
4. Usa un paio di forcep per tenere l'addome all'estremità posteriore e spingere lentamente le ovaie fuori (insieme agli altri contenuti addominali) con l'altra coppia di forcep. In caso di fallimento di questo tentativo, rimuovere con cura l'esoscheletro addominale inserendo le forcep nell'estremità anteriore per rilasciare le ovaie.
5. Usando le forcep, tenere un'ovaia individualedall'estremità posteriore opaca (cioè, leuova piene di tuorlo, in fase avanzata) e spostarla con attenzione nel terzo pozzo del piatto per prendere in giro per elaborarla per microscopia viva o per il fissaggio per eseguire l'immunostaining.
6. Prendere in giro con cura la torcia protettiva da intorno alle ovaie spazzando leggermente un ago stuzzicato dall'estremità posteriore a quello anteriore di ogni ovaio tenendolo all'estremità posteriore con un paio di pini.
   NOTA: Per ridurre al minimo i danni durante la presa in giro, piegare la punta dell'ago e ingrandire ogni ovaio aumentando l'ingrandimento del microscopio (Figura 1A). Prendere in giro dovrebbe essere abbastanza efficace da rompere la tosta, ma dovrebbe anche essere fatto con cura per preservare l'integrità delle ovaiole.

Representative Results

Figura 1: Piano sperimentale e preparazione. (A) Strumenti utilizzati nei metodi descritti: A. Flaconcino a mosca; B. Mezzo di sezionamento degli insetti; C. Paraformaldeide; D. Spazzola a mosca; E. Sezionare il piatto; F. Vetri di copertura; G. Tubo di microfugo. H. Piatto con fondo di vetro; I. Vetri di vetro; J. micropipette da 1.000 μL; K. micropipette da 200 μL; L. micropipette da 2,5 μL; M. Ago da presa in giro con punta piegata (la punta è ingrandita); N. Forcep spesse; O. Forcep sottili. (B) Schema di diagramma di flusso che rappresenta i metodi descritti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000