Melanogaster Drosophila Dissection des ovaires : une technique de préparation des tissus Ex Vivo

Overview

Cette vidéo décrit l’anatomie générale de l’ovaire de Drosophila et comporte une méthode de disséquer des ovaires pour l’imagerie vivante ou fixe.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Parker et coll.,Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation du drosophile (les outils requis sont représentés dans la figure 1A)

1. Pour l’une ou l’autre des expériences décrites, recueillir la drosophile (maintenue à température ambiante, ou 25 °C) dans les 5 jours suivant l’éclosion et les placer dans un flacon rempli de 5 à 7 mL de nourriture Drosophila (voir tableau des matériaux),avec pas plus de 25 mouches dans chaque flacon; maintenir un rapport femelle:mâle de 2:1.
2. Saupoudrer une petite quantité de levure granulée pour stimuler la production d’œufs de Drosophila. Effectuez une manipulation expérimentale dans les 2 à 4 jours.

2. Dissection des ovaires de Drosophila (les outils requis sont représentés dans la figure 1A)

1. Insecte chaud disséquant moyen (voir tableau des matériaux)à température ambiante, 25 °C. Remplir trois puits d’un plat disséquant de huit puits de verre, avec 200 μL de milieu dans chaque puits.
2. Anesthésier la drosophile avec le CO_{2 en} plaçant l’aiguille du pistolet à vent sous la prise de flacon. Placez-les sur un fly pad. À l’aide d’un microscope disséquant, trier 5 femelles et les placer dans le premier puits du plat disséquant. Manipulez un Drosophila à la fois lorsque vous effectuez une microscopie en direct.
3. Tout en regardant à travers l’oculaire du microscope de dissection, couper le thorax de l’abdomen à l’aide de deux paires de forceps. À l’aide des forceps, transférer soigneusement l’abdomen dans le deuxième puits du plat.
4. Utilisez une paire de forceps pour tenir l’abdomen à l’extrémité postérieure, et poussez lentement les ovaires (avec l’autre contenu abdominal) avec l’autre paire de forceps. Si cette tentative échoue, retirez soigneusement l’exosquelette abdominal en insérant les forceps dans l’extrémité antérieure pour libérer les ovaires.
5. À l’aide des forceps, tenir un ovaire individuel par l’extrémité postérieure opaque(c.-à-d.les œufs remplis de jaunes à un stade avancé) et le déplacer soigneusement vers le troisième puits du plat pour taquiner pour le traiter pour la microscopie vivante ou pour la fixation pour effectuer l’immunostaining.
6. Taquiner soigneusement la gaine protectrice autour des ovaires en balayant légèrement une aiguille taquinerie du postérieur à l’extrémité antérieure de chaque ovaire tout en la tenant par l’extrémité postérieure avec une paire de forceps.
   REMARQUE: Pour minimiser les dommages pendant les taquineries, pliez la pointe de l’aiguille et zoomez sur chaque ovaire en augmentant le grossissement du microscope (figure 1A). Taquineries devraient être assez efficaces pour briser la gaine, mais il doit également être soigneusement fait pour préserver l’intégrité des ovarioles.

Representative Results

Figure 1 : Plan expérimental et préparation. (A) Outils utilisés dans les méthodes décrites : A. Flacon de mouche; B. Milieu disséquant des insectes; C. Paraformaldéhyde; D. Brosse à mouches; E. Dissecting plat; F. Couvrir le verre; G. Tube de microfuge. H. Plat à fond de verre; I. Glissière en verre; J. micropipette de 1 000 μL; K. micropipette de 200 μL; Micropipette L. 2,5-μL; M. Aiguille de taquinerie avec une pointe pliée (la pointe est agrandie); N. Forceps épais; O. Forceps minces. (B) Schéma graphique d’écoulement représentant les méthodes décrites. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000