Drosophila melanogaster Disección de ovarios: una técnica para la preparación de tejidos ex vivo

Overview

Este video describe la anatomía general del ovario de Drosophila y presenta un método de disección de ovarios para imágenes en vivo o fijas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparación de Drosophila (las herramientas requeridas se representan en la Figura 1A)

1. Para cualquiera de los experimentos descritos, recoger Drosophila (mantenido a temperatura ambiente, o 25 °C) dentro de los 5 días de eclosión y colocarlos en un vial lleno de 5 - 7 ml de alimentos Drosophila (ver Tabla de Materiales),con no más de 25 moscas en cada vial; mantener una proporción femenina: masculina de 2:1.
2. Espolvorea una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos de Drosophila. Realice la manipulación experimental en un plazo de 2 a 4 días.

2. Disección de los ovarios de Drosophila (las herramientas requeridas se representan en la Figura 1A)

1. Medio de disección de insectos calientes (ver Tabla de Materiales)a temperatura ambiente, 25 °C. Llene tres pozos de un plato de disección de vidrio de ocho pozos, con 200 μL de medio en cada pozo.
2. Anestesia Drosophila con CO₂ colocando la aguja de la pistola de soplado debajo del tapón del vial. Colócalos en una almohadilla de mosca. Usando un microscopio diseccionador, ordene a 5 hembras y colóquelas en el primer pozo del plato de disección. Manipule una Drosophila a la vez al realizar microscopía en vivo.
3. Mientras mira a través del ocular del microscopio de disección, corta el tórax del abdomen usando dos pares de fórceps. Usando las fórceps, transfiera cuidadosamente los abdomens al segundo pozo del plato.
4. Usa un par de fórceps para sujetar el abdomen en el extremo posterior, y empuja lentamente los ovarios hacia fuera (junto con el otro contenido abdominal) con el otro par de fórceps. En caso de que este intento falle, retire cuidadosamente el exoesqueleto abdominal insertando los fórceps en el extremo anterior para liberar los ovarios.
5. Usando los fórceps, sostenga un ovario individual por el extremo posterior opaco(es decir,los huevos rellenos de yema, en etapa tardía) y muévalo cuidadosamente al tercer pozo del plato para burlarse de él para procesarlo para la microscopía en vivo o para la fijación para realizar inmunostaining.
6. Burlarse cuidadosamente de la vaadura protectora de alrededor de los ovarios barriendo una aguja burlándose ligeramente desde la parte posterior hasta el extremo anterior de cada ovario mientras la sostiene por el extremo posterior con un par de fórceps.
   NOTA: Para minimizar el daño durante las burlas, doble la punta de la aguja y acerque cada ovario aumentando la ampliación del microscopio(Figura 1A). Las burlas deben ser lo suficientemente efectivas como para romper la vatina, pero también se debe hacer cuidadosamente para preservar la integridad de los ovarioles.

Representative Results

Figura 1: Plan experimental y preparación. (A) Herramientas utilizadas en los métodos descritos: A. Vial fly; B. Medio de disección de insectos; C. Paraformaldehído; D. Cepillo de mosca; E. Disección de platos; F. Tapar vidrio; G. Tubo de microcombustible. H. Plato con fondo de vidrio; I. Diapositiva de vidrio; J. 1.000-μL micropipette; K. 200-μL micropipette; L. 2.5-μL micropipette; M. Aguja de burla con una punta doblada (la punta se magnifica); N. Fórceps gruesos; Oh. Fórceps delgados. (B) Un esquema de diagrama de flujo que representa los métodos descritos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Vial Plugs	Fisher Scientific	AS273
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000