Volwassen Drosophila-hersenen monteren: een methode om dia's voor confocale beeldvorming voor te bereiden

Overview

Deze video beschrijft een methode om intacte hersenen van volwassen vliegen onder een brugschuif te monteren en toont het protocol dat wordt uitgevoerd op immunostained hersenen voor fluorescerende microscopie.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Kelly et al., Dissectie en immunofluorescente kleuring van mushroom body en fotoreceptor neuronen in volwassen drosophila melanogaster hersenen, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montage volwassen D. melanogaster hersenen op microscoop dia's en beeldvorming

1. Bouw een "brug" glijbaan. Plaats twee "base" coverslips ongeveer 1 cm uit elkaar op een positief geladen dia. Zorg ervoor dat de positief geladen kant van de dia naar boven is gericht. Plak de dekenslips met vingernagellak aan de glijbaan zoals afgebeeld in figuur 1A. Het is meestal handig om de drie buitenranden van elke basisafdekkingsslip af te dichten met vingernagellak om ervoor te zorgen dat de montagemedia niet onder deze basisafdekkingsslips vallen. Laat vingernagellak volledig drogen (10 - 15 min) voordat u verder gaat.
2. Plaats de schuif onder de stereomicroscoop en pipetteer de montagemediaoplossing met de ontlede hersenen in de ruimte tussen de twee afdeklips. Om meer contrast te bieden, is het handig om de zwanenhalslichten zo te manoeuvreren dat ze parallel lopen met het tafelblad.
3. Verwijder extra montagemedia van de glijbaan met behulp van een pipet en zorg ervoor dat u de hersenen niet van de glijbaan pipeteert.
4. Wick weg extra montagemedia. Hierdoor kunnen de hersenen tijdens de volgende stap nauwkeuriger worden gepositioneerd.
5. Plaats de hersenen met behulp van een tang en de stereomicroscoop op de dia in een rasterpatroon met antennelobben naar boven gericht.
6. Plaats een afdekslip (de "brug") over de hersenen (figuur 1A). Gebruik vingernagellak om de zijkanten van de brugafdekkingsslip af te dichten waar ze in contact komen met de "basis" afdekslips.
7. Vul met een p200 pipet langzaam de middelste holte onder de brug met verse montagemedia (figuur 1B). Plaats één druppel per keer op de open rand van de middenafdekkingslip en laat de montagemedia onder de middenbrugafdekkingslip lopen. Ga door totdat de hele holte is gevuld met montagemedia en sluit vervolgens de boven- en onderkant af met duidelijke vingernagellak.
8. Zodra de nagellak droog is, beeldt u de dia's onmiddellijk in of slaat u deze op in een lichtdichte strakke schuifdoos bij -20 °C.
9. Binnen een week, beeld hersenen met behulp van een laser-scanning confocale microscoop met excitatie lasers en filter kubussen geschikt voor de gekozen fluorescerende secundaire antilichamen. Z-stack afbeeldingen van paddestoel lichaam neuronen worden meestal verkregen met behulp van 20X of 40X doelstellingen. Beeldvorming van retinale fotoreceptorneuronen kan een hogere vergroting vereisen.

Representative Results

Figuur 1: Het monteren van hersenen ter voorbereiding op immunofluorescentie beeldvorming. (A) Hersenen zijn gemonteerd op SuperFrost Plus-dia's met een brugdeksel om afvlakking van de hersenen te voorkomen. Twee "base" cover slips worden aan een Superfrost Plus positief geladen glijbaan met duidelijke vingernagellak gelijmd en ontleedde hersenen worden vervolgens op de glijbaan ertussen geplaatst. Een duidelijke "brug" afdekslip wordt boven de hersenen geplaatst en aan de basisafdekkingsslips vastgekleefd. (B) Zodra de nagellak is opgedroogd, wordt Vectashield langzaam onder de brug gepijpt om de fluorescentie van het secundaire antilichaam te behouden. Duidelijke vingernagellak wordt vervolgens gebruikt om de boven- en onderkant van de "brug" afdekslip af te dichten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666