Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

- Ten eerste, immunostain Drosophila larven met markers die verschillende aspecten van NMJ's of neuromusculaire verbindingen benadrukken. Dit is het gebied waar het einde van een motorneuron axon contact maakt met een spier, en de morfologie ervan wordt gebruikt als een uitlezing van de synaptische functie.

Het axon eindigt in verschillende takken die uitstulpingen vormen die boutonen worden genoemd. Neurotransmitters worden vrijgegeven uit boutonen en veroorzaken spiercontractie. Gebieden van neurotransmitterafgifte worden actieve zones genoemd. Hier is de ene marker specifiek voor een synaptisch eiwit dat de NMJ schetst, en de andere marker is voor een eiwit dat aanwezig is in actieve zones.

Verwerf vervolgens NMJ-afbeeldingen met behulp van microscopie en beoordeel hun morfologie kwantitatief met semi-geautomatiseerde beeldanalysesoftware. Pas een vooraf ingestelde reeks softwareopdrachten toe op de afbeeldingen. De uitvoerbestanden bevatten geanalyseerde NMJ-afbeeldingen en morfologische resultaten. De functies die kunnen worden gemeten, zijn onder meer aantal en oppervlakte van boutons, NMJ-lengte en vertakkingsnummer, aantal niet-verbonden NMJ-compartimenten en aantal actieve zones.

In het volgende voorbeeld analyseren we de morfologie van Drosophila NMJs gekleurd met DLG1, een postsynaptische marker, en BRP, een actieve zonemarker.

- Voor dit protocol, genereer beeldstapels van NMJ's en sla ze op als individuele TIFF-bestanden waar kanaal 1 DLG1-kleuring of vergelijkbare marker toont en kanaal 2 BRP-kleuring toont. Om te beginnen maakt u Z-projecties en hyperstacks van de NMJ-afbeeldingsbestanden. Open de plug-inopties en selecteer Drosophila NMJ-morfometrie.

Identificeer nu de unieke bestandsreeks die de microscoop aan de afbeeldingsreeks heeft toegewezen wanneer u ze opslaat als TIFF. Deze bevindt zich aan het einde van de afbeeldingsnaam. Kopieer en plak de tekenreeks die aan het laagste vlak en kanaalnummer is gegeven in het instellingsvenster van de unieke bestandsreeks. Selecteer vervolgens de submacro 'Converteren naar stapel' en kies de map of map waarin de afbeeldingen zich bevinden.

Voor elk afbeeldingsbestand worden twee nieuwe bestanden gemaakt met de standaardnamenstack en platte stapel, gevolgd door de oorspronkelijke afbeeldingsnaam. De oorspronkelijke bestanden kunnen vervolgens worden verwijderd om opslagruimte te besparen. Selecteer vervolgens vanuit de drosophila NMJ-morfometrische interface de gedefinieerde ROI-submacro en kies de map met afbeeldingsbestanden.

Wanneer de eerste projectie wordt geopend, selecteert u het gereedschap selecties uit de vrije hand en gebruikt u vervolgens de muis om een gebied te definiëren dat een volledige NMJ-terminal van belang bevat. Eenmaal geselecteerd, klikt u op OK in het gedefinieerde terminalvenster. Ga hiermee door totdat de NMJ-terminals in alle projecties zijn gedefinieerd. De macro bevordert het proces automatisch. Voor elk afbeeldingsbestand wordt één nieuw bestand gemaakt met de standaardnamen ROI gevolgd door de oorspronkelijke afbeeldingsnaam.

Om de NMJ-functies te kwantificeren, gaat u eerst naar de drosophila NMJ-morfometrie-interface en stelt u de schaal in. Als bijvoorbeeld één pixel van de afbeelding overeenkomt met 0,72 micron, stelt u schaalpixels in op 1 en schaalafstand op 0,072. Selecteer vervolgens de submacro Analyseren en als er twee kanaalafbeeldingen zijn, schakelt u ook Wait in. Druk op OK en selecteer de map met afbeeldingsbestanden.

Na de analyse worden nieuwe afbeeldingsbestanden voor elke geanalyseerde synaps opgeslagen in de ouderlijke map en staan de kwantitatieve metingen in de resultaten.txt bestand. Inspecteer alle afbeeldingen en sluit afbeeldingen met segmentatiefouten uit.

Delen van de synaptische terminal kunnen bijvoorbeeld niet worden opgenomen in de gele omtrek. Delen van de achtergrond kunnen worden opgenomen in de synaptische terminal. Een blauwe skeletlijn kan zich uitstrekken tot voorbij de synaptische terminal. Er kunnen te veel actieve zones zijn of sommige actieve zones kunnen onopgemerkt blijven.