Smak preferanseanalyse: En metode for måling av fôringsatferd i Drosophila

Overview

Denne videoen beskriver smakpreferanseanalysen, en atferdsmetode som brukes til å måle tiltrekning eller unngåelse mot fargede løsninger som smaker annerledes ved å vurdere flyets bukfarge etter inntak av det foretrukne stoffet. Den omtalte protokollen demonstrerer prosedyren som brukes til å måle fluenes preferanse mot løsninger av varierende sukrosekonsentrasjoner.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Bantel og Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Sult

1. Forbered fly sult hetteglass ved å mette en bomullsdott med 18,2 MΩ vann på bunnen av et standard flueflaske. Alternativt kan du på samme måte mette en liten stripe med filterpapir med 18,2 MΩ vann og plassere i en vinkel i hetteglasset.
2. Samle fluer i sett med ~ 100 dyr på en CO₂ pad og legg deretter fluene til et forberedt hetteglass.
   MERK: Beste resultater oppnås med dyr som er mindre enn 5 dager gamle. Imidlertid kan dyrenes eksakte alder kontrolleres som en eksperimentell variabel for å bestemme endringer i smakpreferanse over tid.
3. Bruk en bomullsdott eller skumstopper for å feste hetteglassene som er lukket. Plasser hetteglassene på siden i en miljøkontrollert inkubator. Opprettholde temperaturen ved 25 °C, og fuktigheten over 70 %. La hetteglassene stå urørt i 24 timer.

2. Smak preferanseanalyse

1. Forbered alle smaksstoffer til analysen samme dag som testing.
   MERK: De eksakte smaksmidlene som skal brukes vil variere avhengig av eksperimentelt spørsmål som blir stilt. Følgende er eksempeltastanter som brukes i denne protokollen. Se avsnitt 4 for optimaliseringer.
   1. Forbered kontroll tastant (1 mM sukrose) ved å kombinere 10 μl 100 mM sukroseoppløsning, 13 μl rød matfarging og 977 μl 18,2 MΩ vann.
   2. Forbered eksperimentell tastant (5 mM sukrose) ved å kombinere 50 μl 100 mM sukroseoppløsning, 10 μl blå matfarging og 940 μl 18,2 MΩ vann.
2. Lag analysekamre ved hjelp av en standard 100 mm x 15 mm plast petriskål tilberedt på følgende måte:
   1. Plasser tre 10 μl dråper kontroll tastant nærmest kanten av platen ved 12 og ytterligere 3 dråper klokken 6. Forsikre deg om at avstanden mellom dråper er lik.
   2. Plasser tre 10 μl dråper eksperimentell tastant nærmest kanten av platen klokken 3 og ytterligere 3 dråper klokken 9. Forsikre deg om at avstanden mellom dråper er lik.
   3. Gjenta trinn 2.2.1 og 2.2.2 for så mange replikeringer som ønsket.
3. Tomt 1 hetteglass med ~100 sultne fluer på en CO_2-pute akkurat lenge nok til å bedøve alle dyr (ca. 10 sek). Pensle dyrene inn i midten av et tilberedt analysekammer og dekk med parabollokket.
   MERK: Lengre perioder med CO_{2-eksponering} bør unngås for å forbedre restitusjonstiden og begrense interferensen i fôringsatferden. Eksponering for is (~5 min) kan brukes til bedøvelse for å unngå CO 2-atferdseffekter som kan oppstå ved til og med begrenset eksponering.
4. Plasser analysekammeret i en ugjennomsiktig pappkasse. Pass på at utsiden av esken merkes med tilstanden og genotypen som testes.
5. Plasser hele oppsettet (analysekammeret i pappesken fra trinn 2.4) i en 25 °C inkubator med minst 70 % fuktighet i 2 timer.
6. Gjenta trinn 2.3 til og med 2.5 for alle replikeringer.
7. Etter 2 timer plasserer du analysekamrene, som fortsatt finnes i pappesker, direkte i en -20 °C fryser til den er klar for kvantitet.

3. Smak preferanse analyse kvantifisering

1. La et enkelt analysekammer varme opp til romtemperatur (ca. 5 min).
2. Under et disseksjonsmikroskop, ved hjelp av en børste eller et par tang, gruppedyr basert på fargen på magen: rød, blå, lilla eller klar (Figur 1).
3. Registrer antall dyr i hver gruppering. Vurder klare dyr å ikke ha deltatt i analysen og derfor ikke inkludere dem i noen beregninger.
4. Beregn preferanseindeksen i henhold til en av følgende formler:
   1. Hvis den eksperimentelle interessen legges til det røde fargestoffet, bruk deretter (N_rød + 0,5N_lilla)/(N_rød + N_blå + N_lilla).
   2. Hvis den eksperimentelle tastanten legges til det blå fargestoffet, justerer du ligningen til (N_blå + 0,5N_lilla)/(N_blå + N_rød + N_lilla).
5. Gjenta beregningene for alle eksperimentelle forhold og repliker.

4. Optimalisering av smak preferanseanalyse

1. Empirisk bestemme konsentrasjonen av matfargingsindikatorer som skal brukes, slik at matfarging ikke påvirker utfallet av smaksanalysen, som følger:
   1. Forbered 4 smakstoffer ved hjelp av samme baseforbindelse(f.eks. 5 mM sukrose) som angitt i trinn 2.1, men utelat matfargingen.
   2. Tilsett 1,3% rød matfarging til en av smaksstoffene. Lag de resterende 3 smaksstoffene med blå matfarging av varierende konsentrasjoner i hvert rør(f.eks. 0,6%, 1% og 1,3%).
   3. Fullfør protokolltrinnene 2,2 til 3,4 for hvert tastantpar: 1,3 % rødt mot 0,6 % blått; 1,3 % rød mot 1 % blå og 1,3 % rød mot 1,3 % blå.
   4. Gjenta trinn 4.1.1-4.1.3 med forskjellige prosenter av blå matfarging til preferanseindeksen har en gjennomsnittsverdi på 0 (figur 2).
      MERK: Som utgangspunkt gir 1,3% rød matfarging kombinert med 1% blå matfarging vanligvis gode resultater. Hvis ingen tilfredsstillende konsentrasjon av blå matfarging kan tilpasses 1,3% fargestoff, kan trinn 4.1.1 til 4.1.3 gjentas med varierende konsentrasjoner av rød fargestoffer og en konstant konsentrasjon av blå matfarging.
   5. Analyser alle forhold som skal testes med de samme optimaliserte matfargekonsentrasjonene.

Representative Results

Figur 1: Resultater av preferanseanalyse for smak. Noen eksempler i variasjonen av abdominal farging er vist. Mørk rød inntatt (A). Lys rød inntatt (B). Mørk blå inntatt (C). Lyseblå inntatt (D). Lilla underliv vurderes når hele fargen vises lilla (E), eller når distinkte områder av magen viser deler av rødt (pilspiss) og separate deler av blått (pil) (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Kontrollere for matfargeeffekter. Tilsetningen av matfarging til smaksmidlene bør ikke ha noen effekt på dyrenes smakpreferanse. Variere konsentrasjonen av blått fargestoff samtidig som en konstant konsentrasjon av rødt fargestoff viste en optimal kombinasjon på 1,3% rød til 1,0% blå. Dette angis av en preferanseindeksverdi nær 0,5. Verdier er gjennomsnittet ± standardavvik. *p < 0,05, ***p < 0,001 fra tosidig student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160