Congelación de nematodos: un método para exponer los tejidos de gusano interiores para la tinción

Overview

Este video describe el liongelante, un método para hacer que los tejidos C. elegans sean accesibles para la tinción de anticuerpos alterando la cutícula.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Tinción de anticuerpos del intestino C. elegans

1. fijación
   1. Tome una diapositiva de vidrio limpia y use poli-L-lisina para generar una película delgada para que los gusanos se peguen. Coloque 30 μL 0.1-0.2% poli-L-lisina en la diapositiva y coloque una segunda diapositiva en la gota de poli-L-lisina para hacer un "sándwich". A continuación, frote suavemente los toboganes unas cuantas veces para mojar todas las superficies de ambos y dejar que se sequen al aire durante 30 minutos. Etiquete el lado esmerilado de las diapositivas con lápiz.
      NOTA: 0.2% alíquesas de poli-L-lisina de 200 μL se hicieron disolviendo el polvo en dH₂O; esto se puede almacenar a -20 °C. Utilice poli-lisina de alto peso molecular para mejorar la adherencia de los gusanos. La concentración de poli-L-lisina también es crítica. Concentraciones demasiado bajas no permitirán que los gusanos se peguen, pero concentraciones demasiado altas pueden generar señal de fondo de fluorescencia. Una película demasiado gruesa puede aflojarse en su totalidad.
   2. Coloque un bloque metálico plano firmemente en la parte inferior de un recipiente(por ejemplo, un recipiente de poliestireno) lleno de nitrógeno líquido.
      NOTA: Uno puede usar hielo seco en su lugar, pero el nitrógeno líquido mantiene un bloque de metal más estable en el fondo del recipiente y se enfría bien.
   3. Recoger gusanos ya sea lavándolos de sus platos con M9 o recoger diferentes gusanos de etapa (ya sea huevos, L1, L2, L3, o gusanos de etapa larvaria L4) en cada tobogán. Por lo general, elija ~100 larvas y embriones o ~20 adultos para cada diapositiva. Coloque 10 μL de gusanos lavados en el centro de la diapositiva o elija huevos/gusanos en 10 μL M9 o 10 μL 1x PBS (solución salina tamponada de fosfato).
      1. Utilice una pipeta para extender un gran número de gusanos para evitar aglomeraciones.
         Nota: Las poblaciones mixtas de gusanos lavados, debido al hacinamiento y el grosor diferente de las etapas, no se pegan bien y se congelan menos eficazmente (ver abajo), por lo tanto, elegir gusanos específicos de la etapa (o poblaciones sincronizadas) da resultados superiores. Las larvas se pegan mejor que los adultos y se pueden colocar más animales por tobogán.
      2. Antes de recoger gusanos en diapositivas, transfiéralos a una placa de Nematodo Growth Medium (NGM) sin bacterias OP50. El exceso de bacterias adherentes a los gusanos también puede interferir con el adherencia. Tenga cuidado de que los gusanos no se sequen.
   4. Coloque suavemente (suelte) una × de 22 mm sobre los gusanos recogidos de modo que sus bordes se cuelguen en al menos un lado de la diapositiva. Presione hacia abajo suavemente pero firmemente con uno o dos dedos en el clip. Evite cizallamiento que dañe la integridad del tejido.
   5. Transfiera inmediatamente y suavemente la diapositiva al bloque metálico en nitrógeno líquido y deje reposar durante unos 5 minutos para congelarla. A continuación, "deslice" el control de cubierta en un movimiento rápido mediante el borde que sobresale.
      NOTA: Este paso debe hacerse con decisión y mientras el tobogán está congelado para lograr el "agrietamiento" de la cutícula. Precaución: Por favor, siga las directrices ppe (equipo de protección personal) al trabajar con nitrógeno líquido.
   6. Sumerja los toboganes congelados en un frasco de coplina de vidrio relleno de metanoldurante 5 minutos a -20 °C. A continuación, transfiéralo a un frasco de coplina de vidrio relleno de acetonadurante otros 5 minutos a -20 °C.
      NOTA: El metanol y la acetona deben almacenarse en -20 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso. Después de la fijación, las diapositivas se pueden almacenar a -20 °C.
      PRECAUCIÓN: el metanol y la acetona son tóxicos.
   7. Retire los toboganes del frasco y déjelos secar al aire a temperatura ambiente (RT) antes de usarlos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC