Congelamento de nematoides: um método para expor tecidos de vermes interiores para coloração

Overview

Este vídeo descreve o congelamento, um método para tornar os tecidos C. elegans acessíveis para coloração de anticorpos, interrompendo a cutícula.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Zhang et al, The C. elegans Intestinal As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Mancha de anticorpo do intestino C. elegans

1. fixação
   1. Pegue um slide de vidro limpo e use poli-L-lysine para gerar um filme fino para os vermes ficarem. Coloque 30 μL 0,1-0,2% de poli-L-lysine no slide e coloque um segundo slide na gota de poli-L-lysina para fazer um "sanduíche". Em seguida, esfregue os slides suavemente algumas vezes para molhar todas as superfícies de ambos e deixá-los secar por 30 minutos. Rotule o lado fosco dos slides com lápis.
      NOTA: 0,2% alíquotas de poli-L-lisina de 200 μL foram feitas dissolvendo o pó em dH₂O; isto pode ser armazenado a -20 °C. Use poli-l-lysina de alto peso molecular para melhor aderência dos vermes. A concentração de poli-L-lysina também é crítica. Concentrações muito baixas não permitirão que os vermes grudem, mas concentrações muito altas podem gerar sinal de fundo de fluorescência. Um filme muito grosso pode se soltar em sua totalidade.
   2. Coloque um bloco metálico plano firmemente no fundo de um recipiente (por exemplo, um recipiente de poliestireno) cheio de nitrogênio líquido.
      NOTA: Pode-se usar gelo seco em vez disso, mas o nitrogênio líquido mantém um bloco de metal mais estável no fundo do recipiente e esfria bem.
   3. Colete vermes lavando-os de seus pratos com M9 ou escolha diferentes vermes de palco (ovos, L1, L2, L3 ou vermes de estágio larval L4) em cada lâmina. Normalmente, escolha ~100 larvas e embriões ou ~20 adultos para cada slide. Coloque 10 μL lavados vermes no meio do slide ou escolha ovos/vermes em 10 μL M9 ou 10 μL 1x PBS (soro fisiológico tamponado de fosfato).
      1. Use uma pipeta para espalhar um grande número de vermes para evitar a aglomeração.
         Nota: Populações mistas de vermes lavados, devido à aglomeração e diferentes espessuras de estágios, não grudam bem e são menos eficazes (veja abaixo), portanto, escolher vermes específicos do palco (ou populações sincronizadas) dá resultados superiores. Larvas ficam melhores que adultos e mais animais podem ser colocados por lâmina.
      2. Antes de colher vermes em slides, transfira-os para uma placa de Nematode Growth Medium (NGM) sem bactérias OP50. O excesso de bactérias aderindo aos vermes também pode interferir na degola. Tome cuidado para que os vermes não sequem.
   4. Coloque suavemente (gota) um deslizamento de cobertura de 22 mm × de 22 mm em cima dos vermes coletados, de modo que suas bordas pairam sobre pelo menos um lado do slide. Pressione para baixo suavemente, mas firmemente com um ou dois dedos na tampa. Evite o corte que danificará a integridade do tecido.
   5. Transfira imediatamente e suavemente o slide para o bloco metálico em nitrogênio líquido e deixe descansar por cerca de 5 minutos para congelar. Em seguida, "flick off" o deslizamento de cobertura em um movimento rápido usando a borda pendente.
      NOTA: Esta etapa deve ser feita de forma decisiva e enquanto o slide estiver congelado para alcançar a "rachadura" da cutícula. Atenção: Siga as diretrizes do EPI (Equipamento de Proteção Individual) ao trabalhar com nitrogênio líquido.
   6. Mergulhe os slides congelados em um frasco de coplin de vidro cheio de metanolpor 5 min a -20 °C. Em seguida, transfira para um frasco de coplin de vidro cheio de acetonapor mais 5 minutos a -20 °C.
      NOTA: Metanol e acetona devem ser armazenados em -20 °C por pelo menos 30 minutos antes de usar. Após a fixação, os slides podem ser armazenados a -20 °C.
      ATENÇÃO: metanol e acetona são tóxicos.
   7. Remova os slides do frasco e deixe-os secar à temperatura ambiente (RT) antes de usar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC