Overview
सी एलिगेंसकी लाइव इमेजिंग के दौरान, एक एगरल्ड पैड का उपयोग नेमाटोड को अभी भी हानिकारक या सुखाने के बिना रखने के लिए किया जा सकता है। इस वीडियो में माइक्रोस्कोपी के लिए एक साधारण बढ़ते पैड को कैसे तैयार किया जाता है, इसका वर्णन किया गया है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल टेओह एट अल, कैरोहाथिटिस एलिगेंस,जे विस एक्सपी (2019) में सेलुलर संरचनाओं और ऑर्गेनेल मॉर्फोलॉजी का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोणसे कुछ अंश है।
इमेजिंग के लिए स्लाइड्स की तैयारी
- माइक्रोवेव-सेफ बॉटल (अल्ट्रापुरे पानी के 100 एमएल में 3-4 ग्राम) में 3-4% डब्ल्यू/वी एगर्लाग स्टॉक तैयार करें।
नोट: एगर का उपयोग एक ही एकाग्रता पर एगर के स्थान पर किया जा सकता है। - एक माइक्रोवेव ओवन में सावधानी से agarose पिघला, देखभाल करने के लिए फोड़ा पर नहीं, जब तक सभी agarose घुल (स्पष्ट समाधान) । ठोसकरण को रोकने के लिए समाधान 70 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: एगर उठे स्टॉक का कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि एगर उठे हुए जम गए हैं तो उपयोग से पहले फिर से गरम करें। - एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, पिघले हुए एगर की एक बूंद को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
नोट: एगर की बूंद में हवा के बुलबुले होने से बचें क्योंकि ये पैड की अखंडता को बाधित करते हैं। - तुरंत एक और माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ agarose बूंद नीचे प्रेस, धीरे से दो स्लाइड के बीच एक पैड में agarose सपाट ।
नोट: इस स्तर पर किसी भी बचे हुए बुलबुले को हटा दिया जाना चाहिए। यदि नहीं, तो नई स्लाइड बनाई जानी चाहिए क्योंकि जानवर आसानी से बुलबुले में फंस सकते हैं। स्लाइड पर दबाव डालते समय आगर के ओवरफ्लो से बचें। - एगर उठे को 1 मिनट तक सूखने के लिए छोड़ दें।
- एक स्लाइड पर जम पैड छोड़ते हुए एगरे को नुकसान से बचने के लिए दो स्लाइड्स को ध्यान से अलग करें।
नोट: एगर उठे पैड के साथ स्लाइड हमेशा प्रयोग से ठीक पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि वे सूख सकते हैं। सुनिश्चित करें कि एगर उठे पैड में लगातार मोटाई है। पैड में कोई हवा के बुलबुले या दरारें नहीं होनी चाहिए क्योंकि यह इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है। - एग्राजॉर्ज पैड के केंद्र में 0.05% टेट्रामिसोल हाइड्रोक्लोराइड (एनेस्थेटिक) की एक छोटी बूंद (5-10 माइक्रोल) जोड़ें।
- गर्मी-निष्फल लेने का उपयोग करके, समाधान सूखने से पहले स्टॉक प्लेट से लगभग 10 -15 जानवरों को एनेस्थेटिक बूंदों में स्थानांतरित करें। बहुत अधिक OP50 बैक्टीरिया को स्थानांतरित करने से बचें क्योंकि इससे समाधान बादल छाए रहते हैं, जो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
नोट: यदि एनेस्थेटिक समाधान उठाते समय सूख जाता है, तो बस जानवरों पर 0.05% टेट्रामिसोल हाइड्रोक्लोराइड की दूसरी बूंद को पिपेट करें। जानवर एनेस्थेटिक समाधान में अपने पार्श्व पक्ष पर रखना करते हैं। - इसे एगर उठे पैड के ठीक ऊपर पोजिशनिंग करके एक कवरस्लिप लागू करें और धीरे-धीरे इसे नीचे गिरा दें। इससे बुलबुले बनने से रोका जा सकेगा। कवरलिप पर दबाव न लगाएं क्योंकि इससे जानवरों को कुचल सकता है।
- तनाव नाम के साथ स्लाइड लेबल।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
