Preparazione scivolo nematode: un metodo per montare gli animali su un tampone di agar

Overview

Durante l'imaging dal vivo di C. elegans, un tampone di agarosio può essere utilizzato per tenere fermo il nematode senza danneggiarlo o asciugarlo.  Questo video descrive come preparare un semplice pad di montaggio per la microscopia.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.

Preparazione di diapositive per l'imaging

1. Preparare il 3-4% con lo stock di agarosio in una bottiglia a microonde sicura (3-4 g in 100 ml di acqua ultrapura).
   NOTA: L'agar può essere usato al posto dell'agarosio alla stessa concentrazione.
2. Sciogliere accuratamente l'agarosio in un forno a microonde, facendo attenzione a non bollire troppo, fino a quando tutto l'agarosio si dissolve (soluzione chiara). Mantenere la soluzione a 70 °C per evitare la solidificazione.
   NOTA: Lo stock di agarosio può essere utilizzato più volte. Surriscaldare prima dell'uso se l'agarosio si è solidificato.
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, posizionare una goccia di agarosio fuso su uno scivolo al microscopio.
   NOTA: Evitare di avere bolle d'aria nella goccia di agar in quanto queste interrompono l'integrità del pad.
4. Premere immediatamente la goccia di agarosio con un altro vetrino del microscopio, appiattindo delicatamente l'agarosio in un cuscinetto tra le due diapositive.
   NOTA: Eventuali bolle rimanenti dovrebbero essere rimosse in questa fase. In caso meno, dovrebbero essere fatte nuove diapositive in quanto gli animali possono facilmente rimanere bloccati nelle bolle. Evitare l'overflow dell'agar di lato quando si preme sulla diapositiva.
5. Lasciare asciugare l'agarosio per 1 minuto.
6. Separare accuratamente le due diapositive per evitare danni all'agarosio, lasciando il pad solidificato su una delle diapositive.
   NOTA: Le diapositive con tamponi di agarosio devono sempre essere preparate fresche appena prima dell'esperimento in quanto possono asciugarsi. Assicurarsi che il tampone di agarosio abbia uno spessore costante. Non dovrebbero esserci bolle d'aria o crepe nel pad in quanto ciò potrebbe interferire con l'imaging.
7. Aggiungere una piccola goccia (5-10 μL) dello 0,05% di tetramisolo cloridrato (anestetico) al centro del tampone di agarosio.
8. Utilizzando il piccone sterilizzato termicamente, trasferire rapidamente circa 10 - 15 animali dalla piastra di scorta alla goccia anestetica prima che la soluzione si ascili. Evita di trasferire troppi batteri OP50 in quanto ciò rende la soluzione torbosa, il che può interferire con l'imaging.
   NOTA: Se la soluzione anestetica si asciuga durante la raccolta, è sufficiente pipettare una seconda goccia dello 0,05% di cloridrato di tetramisolo sugli animali. Gli animali tendono a sdraiarsi sul loro lato laterale nella soluzione anestetica.
9. Applicare un coverslip posizionandolo appena sopra il tampone di agarosio e facendolo cadere delicatamente verso il basso. Ciò impedirà la formazione di bolle. Non applicare pressione sul coverslip in quanto ciò potrebbe schiacciare gli animali.
10. Etichettare le diapositive con il nome della deformazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G