선충 슬라이드 준비 : 한천 패드에 동물을 탑재하는 방법

Overview

C. elegans의라이브 이미징 동안, 아가로즈 패드는 손상하거나 건조하지 않고 선충을 여전히 보유하는 데 사용할 수 있습니다.  이 비디오는 현미경 검사법을 위해 간단한 장착 패드를 준비하는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Teoh 외, 케노르하비티스 엘레간에서세포 구조 및 세포구체 형태학을 연구하기위한 정량적 접근법,J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌됩니다.

이미징용 슬라이드 준비

1. 전자레인지 용 병(초순수 100mL3-4g)에 아가로즈 육수를 3-4% 준비합니다.
   참고: 한천은 같은 농도로 아가로즈 대신 사용할 수 있다.
2. 모든 아가로즈가 녹을 때까지 끓이지 않도록 주의하면서, 전자레인지에 아가로즈를 조심스럽게 녹입니다(명확한 용액). 용액을 70°C로 유지하여 응고를 방지합니다.
   참고: 아가로즈 스톡은 여러 번 사용할 수 있습니다. 아가로즈가 고화된 경우 사용하기 전에 다시 가열합니다.
3. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 녹은 아가로즈 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
   참고: 이러한 패드의 무결성을 방해로 한천의 드롭에 기포가 없는 것을 피하십시오.
4. 즉시 아가로즈 방울을 다른 현미경 슬라이드로 누르고 아가로즈를 두 슬라이드 사이의 패드로 부드럽게 평평하게 합니다.
   참고: 남은 거품은 이 단계에서 제거해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 동물이 쉽게 거품에 갇혀 얻을 수 있기 때문에 새로운 슬라이드를 만들어야한다. 슬라이드를 누를 때 한천이 옆으로 넘쳐나는 것을 방지하십시오.
5. 아가로즈를 1분 동안 건조시라.
6. 두 슬라이드를 조심스럽게 분리하여 아가로즈의 손상을 방지하고 슬라이드 중 하나에 고형패드를 남깁니다.
   참고: 아가로즈 패드가 있는 슬라이드는 건조할 수 있기 때문에 실험 직전에 항상 신선하게 준비해야 합니다. 아가로즈 패드에 일관된 두께가 있는지 확인합니다. 이 이미징을 방해 할 수 있기 때문에 패드에 기포 또는 균열이 없어야한다.
7. 아가로즈 패드의 중앙에 0.05% 테트라미솔 염산염(마취)의 작은 낙하(5-10 μL)를 추가한다.
8. 열 살균 된 선택을 사용하여 용액이 건조되기 전에 스톡 플레이트에서 마취액으로 약 10 - 15 마리의 동물을 신속하게 이송하십시오. 이 이미징을 방해 할 수있는 용액흐림으로 너무 많은 OP50 박테리아를 전송하지 마십시오.
   참고: 마취용액이 피킹하는 동안 건조하면 동물에 0.05% 테트라미솔 염산염을 두 번째 방울로 떨어뜨리기만 하면 됩니다. 동물은 마취 용액에서 측면 측면에 누워있는 경향이 있습니다.
9. 아가로즈 패드 바로 위에 위치하여 커버슬립을 바르고 부드럽게 떨어뜨립니다. 이것은 거품의 형성을 방지할 것입니다. 이 동물을 분쇄 할 수 있기 때문에 커버 슬립에 압력을 적용하지 마십시오.
10. 슬라이드에 변형 이름으로 레이블을 지정합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G