Overview
Burada, genomik DNA'yı sabit, bozulmamış nematodlarda görselleştirmek için kullanılan bir tekniği tarif ediyoruz. Video, döllenmemiş C. elegans oositlerindeki kromatinleri saymak için örnek bir protokol içerir.
Protocol
Bu protokol Clarke ve ark .
Tetraploid suşları, kısırlaştırılmamış oositlerindeki kromozom sayısı sayılarak doğrulanabilir. Floresan mikroskopi, suşun kromozomlar için floresan bir işaretleyicisi varsa, döllenmemiş diploid oositlerdeki (meiotik bölünmelerden önce) kromozom çiftlerinin sayısını taramak için kullanılabilir. Floresan kromozom belirteçlerinin yokluğunda, tetraploid nematodlar nematodların sabitlenerek ve DNA boyası ile boyanarak taranabilir; Etanol sabitleme ve tüm hayvan için bir protokol için aşağıya bakın 4′,6-Diamidin-2′-fenylindole dihidrochloride (DAPI) boyama.
Tüm hayvan DAPI boyama
NOT: 12 bağlı kromozom çifti taşıyan tetraploid suşları, DAPI'nın bu hayvanları lekelemesi ve kısırlaştırılmamış oositlerindeki DAPI cisimlerinin sayısını sayarak doğrulanabilir.
- Bir mikroskop kaydırağine 5 ila 10 μL M9 tampon yerleştirin, ardından damlaya 6 - 10 nematod aktarın.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, nematodları tüy bırakmayan bir temizleme dokusuyla çıkarmadan M9'un çoğunu damladan çekin. Ardından, solucanlara hemen% 90 etanol 10 μL'lik bir damla ekleyin. Solucanların tamamen kurumasına izin verin, ancak birkaç saniyeden fazla değil.
- Etanol buharlaşır buharlaşmaz (bu, diseksiyon mikroskobu altında olduğu gibi görülebilir), solucanların üzerine% 90 etanol ek 10 μL ekleyin.
- 3.1.3 adımlarını üç kez daha yineleyin.
- Etanol son damlası buharlaştıktan sonra, tercih edilen montaj ortamlarında önerilen son konsantrasyona 6 μL DAPI veya Hoechst boyası ekleyin (örneğin, M9'daki 2 ng / μL DAPI stok konsantrasyonunun 1:1.000 seyreltilmesi). Slaytların uzun süreli depolansınca, 20 mM Tris-HCl'de çözünen %0,5 p-fenilenediamin, pH 8,8, sadece M9 yerine antifad çözeltisi olarak %90 gliserol kullanılabilir.
- Slayttaki solucanları bir kapakla örtün ve kapakçığın kenarlarını oje ile kapatın. Kapak kapağını ekledikten en az 10 dakika sonra floresan mikroskopta (adım 3.1.7) puan. Antifade içermeyen slaytlar puanlamadan önce 4 °C'de birkaç gün saklanabilir, ancak floresan kalitesi birkaç gün sonra düşmeye başlar.
- 100X büyütmede floresan mikroskop kullanarak, spermatheca'ya hemen bitişik olan ve henüz spermatheca veya uterusa girmemiş olan en olgun döllenmemiş oositteki tek DAPI cisimlerinin (muhtemelen tek kromozom çiftleri) sayısını puanlayın.
- Bir oosit çekirdeği içindeki tek tek DAPI gövdelerini puanlamak için, sayım sırasında oosit çekirdeğinin tepesinden dibe doğru yavaşça hareket etmek için mikroskobun ince odağını kullanın. Daha sonra, sayılan DAPI gövdesi sayısını doğrulamak için odağı ters yönde(yaniçekirdeğin altından üstüne) taşırken aynı çekirdeği yeniden anlatın.
- kararlı Lon suşu başına en az on hermafrodit içinde iki gonadların her birinde en olguntilize edilmemiş oosit puan. Yabani tip oositler ortalama 6 DAPI gövdesine, 5 otozom çiftine ve cinsiyet kromozom çiftine sahiptir. Kararlı Lon suşlarının oositinde 12 DAPI gövdesinin varlığı, bu suştaki hayvanların ya kısmi (4 set Otozom, 3 X kromozom) ya da tam (4 otozom, 4 X kromozom kümesi) tetraploid olduğunu gösterir.
- Suş başına birden fazla (en az 10) oositten gözlenen ortalama DAPI gövdesi sayısını hesaplayın. Bazı kromozom çiftleri birbirine dokunacak veya üst üste gelecektir, bu nedenle bir oositteki DAPI gövdelerinin sayısı genellikle gerçek kromozom çiftlerinin sayısından daha azdır.
- (İsteğe bağlı) HTP-3 gibi kromozom eksen proteinlerine karşı immünoforezsans lekeleme ile ortalama DAPI cisimlerinin dolu (4A, 4X) veya kısmi (4A, 3X) tetraploid olup olmadıklarını test etmek için ortalama dapi cisimlerinin 12 olduğu stabil Lon suşlarını daha da doğrulayın. Bu lekeleme, kısmi tetraploidde bulunan tek bağlantısız kromozomlardan haç deseni göstererek kromozom çiftlerini ayırt edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 |
