Microinjection d’embryons vivants de drosophile : livraison précoce de réagentines à l’embryon en développement

Overview

Cette vidéo décrit comment effectuer des microinjections qui fournissent des réagentineurs dans des embryons vivants de Drosophila. Les chercheurs peuvent utiliser cette méthode pour introduire des composés exogènes comme les acides nucléiques et les protéines au cours des premiers stades du développement embryonnaire. Le protocole en vedette montre comment mettre en place et effectuer la procédure d’injection de n’importe quel reagent soluble-ici, une protéine fluorescente pour les expériences d’imagerie en direct.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Brust-Mascher et Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).

Recettes:

Assiettes de jus de raisin:

• 5.5g bacto agar

• 14,5 g de dextrose ou de glucose

• 7,15 g de saccharose

• 45 ml de concentré de jus de raisin (100% de jus).

• 204,5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

Mélanger tous les ingrédients et cuire au micro-ondes jusqu’à ébullition.
Ajouter 2,8 ml de mélange acide (mélange acide : 20,9 ml d’acide propionique, 2,1 ml d’acide phosphorique, 27 ml de H₂0)

Mélanger et verser sur des boîtes de Pétri de 35 mm. Laisser solidifier à température ambiante pendant un ou deux jours. Si les plaques ne seront pas utilisées de sitôt, sceller avec du parafilm et les maintenir à 4 °C (laisser équilibrer à RT avant d’utiliser).

Pâte de levure:
Dissoudre environ une cuillère à café de levure (Sigma YSC2, levure de Saccharomyces cerevisiae type II) dans l’eau pour former une pâte épaisse. Placez une petite quantité de ceci sur chaque plaque de jus de raisin juste avant l’utilisation.

Tampon d’injection :

• 150 mM K-Aspartate

• 10 mM K-phosphate

• Imidazole de 20 mM, pH 7,2

Colle d’heptane :
Déroulez du ruban adhésif double et placez-le dans une bouteille de 100 ml, ajoutez environ 50 ml d’heptane, scellez la bouteille et secouez pendant plusieurs jours. Lors de l’utilisation, ajouter de l’heptane si la colle est trop épaisse.

Chambre de déshydratation:
Prenez une boîte de Pétri de 100 mm, mettez une partie d’un plat de 35 mm à l’intérieur pour faire une « table » et ajoutez de la drierite (sulfate de calcium anhydre) autour de lui de sorte que la hauteur de la drierite n’est pas plus élevée que la « table » et couvrir. Le coverslip avec des embryons sera placé sur cette « table » pour la déshydratation avant l’injection. C’est une bonne idée d’utiliser au moins certains indiquant Drierite et le changer quand il a changé de couleur.

protocole:
Ce protocole peut être utilisé pour l’injection de pratiquement n’importe quel réagien soluble dans l’embryon syncytial Drosophila: Par exemple, soit une protéine fluorescente pour l’observation ou un inhibiteur de protéines cibles ou les deux.

1. Collecte d’embryons

1. Mettre une nouvelle assiette de jus de raisin sur la cage à laïs.
2. Retirez cette plaque après une heure, c’est la première collection de la journée et souvent n’est pas très bon. Il peut être jeté.
3. Changez la plaque toutes les heures pour continuer à recueillir des embryons pendant une heure chacun.

2. Préparation de coverslip

1. Mettez un coverslip de 50 x 22mm sur un côté d’une lame de microscope. Tapez les quatre coins à la diapositive de sorte qu’il ne bouge pas.
2. À l’aide d’un applicateur à pointe de coton, mettre une couche de colle d’heptane dans une ligne sur le coverslip (la colle ne doit pas être visqueuse et devrait sécher en quelques secondes, sinon ajouter plus d’heptane).
3. Placez un morceau de ruban adhésif double sur la glissière vers le côté du coverslip.

3. Préparation d’embryons

REMARQUE: Les embryons doivent être photographiés environ 2 heures après le début de la collecte, alors commencez les étapes suivantes, ce qui laisse suffisamment de temps pour les terminer dans ce délai.

1. À l’aide d’une brosse humidifié, ramasser soigneusement les embryons de l’assiette de jus de raisin et les déposer sur du ruban adhésif double sur la toboggan.
2. À l’aide de la partie externe de la pince à épiler, rouler les embryons sur le ruban adhésif double jusqu’à ce que le chorion (la membrane externe) s’ouvre.
3. Ramasser l’embryon en le roulant doucement sur le chorion afin qu’il colle à la pince à épiler et le placer sur la colle d’heptane sur le coverslip avec le long côté de l’embryon parallèle au côté long de la couverture. Mettre en place 10 à 20 embryons en une rangée.
4. Retirez le coverslip et placez-le dans la chambre de déshydratation pendant 3 à 8 minutes (cela dépend de l’humidité de la pièce et de la quantité à injecter).
5. Déposer sur une chambre métallique avec de la graisse sous vide.
6. Couvrir les embryons d’huile d’halocarbone 700 pour éviter d’autres déshydratations. Les embryons sont maintenant prêts pour l’injection.

4. Injection d’embryons

1. Trouvez les embryons dans un objectif de 16x.
2. Éloignez les embryons et trouvez l’aiguille sans déplacer le plan focal.
3. Centrez l’aiguille et déplacez-la vers le haut sans la déplacer dans la direction x ou y.
4. Si l’aiguille n’est pas ouverte, placez le bord du coverslip dans le champ de vision, mais pas où l’aiguille sera, et abaissez l’aiguille au même plan focal. Déplacez très soigneusement le coverslip jusqu’à ce qu’il touche l’aiguille et la brise doucement ouverte. Si l’aiguille est ouverte, passez à l’étape 5. (Les aiguilles peuvent être ouvertes avec de l’acide fluorhydrique avant de les remplir).
5. Mettez les embryons en vue (mais pas où l’aiguille sera), abaissez l’aiguille dans l’huile et assurez-vous d’obtenir de belles gouttes liquides de l’aiguille.
6. Déplacez soigneusement mais régulièrement l’embryon dans l’aiguille et injectez une goutte dans l’embryon et éloignez l’embryon. (Ou suivez les instructions de votre appareil d’injection).
7. Après que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts pour l’observation sur un microscope confocal.