Microinjection d’embryons vivants de drosophile : livraison précoce de réagentines à l’embryon en développement

- Recueillir des embryons vivants de Drosophila et enlever leurs chorions non transparents. Puis, sur un couvercle en verre, appliquer une ligne de colle d’heptane, qui est adhésif de bande dissous dans l’heptane liquide. Pour être en mesure de manipuler les embryons maintenant déchorionated, alignez soigneusement les spécimens dans une rangée sur l’adhésif.

Transférer le coverslip dans une chambre de déshydratation pour dessiccate partiellement les embryons. Ceci empêchera la fuite cytoplasmique pendant ou après des injections. Ensuite, enlevez le coverslip et couvrez les embryons avec l’huile d’halocarbone pour empêcher davantage de déshydratation tout en permettant à l’oxygène de se diffuser dans les embryons.

Pour effectuer la microinjection, utilisez un système de microinjection sur un microscope compatible. En regardant à travers les morceaux des yeux, identifiez à la fois les embryons et l’aiguille préchargée avec une solution d’injection. Ouvrez l’aiguille et assurez-vous qu’elle produit des gouttes liquides cohérentes et de taille appropriée. Ensuite, apportez l’aiguille à l’intérieur de l’embryon et injectez le volume approprié. Sortez l’aiguille et passez à l’autre, en répétant l’injection pour les embryons restants.

Dans le protocole d’exemple, nous verrons une démonstration de la microinjection embryonnaire de Drosophila pour des études d’imagerie vivante de la division cellulaire.

- Avant de mettre en place le coverslip, faire de la colle d’heptane en déballant du ruban adhésif double, et le placer dans une bouteille de 100 millilitres. Ajouter environ 50 millilitres d’heptane, sceller la bouteille, et la bercer pendant plusieurs jours.

Avant de préparer les embryons, faire une chambre de déshydratation dans laquelle les embryons seront placés avant l’injection. Pour ce faire, placez une partie d’un plat de 35 millimètres à l’intérieur d’une boîte de Pétri de 100 millimètres pour faire une « table ». Ajouter la drierite, qui est du sulfate de calcium anhydre, autour de lui de sorte que la hauteur de la Drierite n’est pas plus élevée que la « table », et couvrir.

Pour commencer à préparer les embryons, recueillez-les d’abord dans la cage de la pose en changeant l’assiette de jus de raisin avec de la levure toutes les heures. Les embryons doivent être photographiés environ deux heures après le début de la collecte. Pour préparer le coverslip, placez-le d’un côté d’une lame de microscope et tapez les quatre coins vers le bas, de sorte qu’il ne bouge pas.

À l’aide d’un applicateur à pointe de coton, mettre une couche de colle d’heptane dans une ligne sur le coverslip. La colle ne doit pas être visqueuse et sécher en quelques secondes. Si elle est trop épaisse, ajouter plus d’heptane.

Enfin, mettez un morceau de ruban adhésif doublement collant sur la glissière à côté du coverslip. Avec une brosse humidifié, ramassez soigneusement les embryons de l’assiette de jus de raisin et placez-les sur le ruban adhésif double sur la lame.

Ensuite, utilisez la moitié d’une pince à épiler pour rouler les embryons sur le ruban adhésif double jusqu’à ce que le chorion s’ouvre. Ramasser l’embryon en le roulant doucement sur la chorion, de sorte qu’il colle à la pince à épiler, et le placer sur la colle heptane sur le coverslip avec le côté long de l’embryon parallèle au long côté de la pince à épiler.

Placer 10 à 20 embryons dans une rangée. Retirer le coverslip et le placer dans la chambre de déshydratation pendant trois à huit minutes. Le temps dépend de l’humidité locale et de la quantité à injecter. Ensuite, placez le coverslip sur une chambre métallique avec de la graisse sous vide. Enfin, recouvrez les embryons d’huile d’halocarbone pour éviter une déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés.

Tout d’abord, trouvez les embryons dans un objectif de 16 X. Éloignez les embryons et trouvez l’aiguille sans déplacer le plan focal. Centrez l’aiguille et déplacez-la vers le haut sans la déplacer dans la direction X ou Y.

Pour ouvrir l’aiguille, placez le bord du coverslip dans le champ de vision, mais pas là où sera une aiguille, et abaissez l’aiguille au même plan focal. Très soigneusement, déplacez le coverslip jusqu’à ce qu’il frappe l’aiguille et la brise doucement ouverte. Déplacez l’aiguille vers le haut.

Maintenant, amenez les embryons en vue. Abaissez l’aiguille dans l’huile et assurez-vous d’obtenir de belles gouttes liquides de l’aiguille. Déplacez régulièrement l’embryon dans l’aiguille, injectez une goutte dans l’embryon, puis éloignez l’embryon. Après que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observations au microscope confocal avec un objectif de 60 ou 100 X.