Microinjeção de Embriões DeSerção Viva Drosophila: Entrega antecipada de reagentes ao embrião em desenvolvimento

- Coletar embriões de Drosophila vivos e remover seus acordes não transparentes. Em seguida, em um deslizamento de vidro, aplique uma linha de cola de heptano, que é adesivo de fita dissolvida em heptano líquido. Para ser capaz de lidar com os embriões agora descorrioados, alinhe cuidadosamente os espécimes em uma fileira sobre o adesivo.

Transfira o deslizamento de tampas para uma câmara de desidratação para dessecar parcialmente os embriões. Isso evitará vazamento citoplasmático durante ou após as injeções. Em seguida, remova o deslizamento de tampa e cubra os embriões com óleo de halocarbono para evitar uma desidratação adicional, permitindo ainda que o oxigênio se difunda nos embriões.

Para realizar a microinjeção, use um sistema de microinjeção em um microscópio compatível. Olhando através dos pedaços dos olhos, identifique tanto os embriões quanto a agulha pré-carregada com solução de injeção. Quebre a agulha e garanta que ela produz gotas líquidas consistentes e de tamanho apropriado.

No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração da microinjeção de embriões de Drosophila para estudos de imagem ao vivo da divisão celular.

- Antes de configurar o deslizamento de cobertura, faça a cola heptane desenrolando fita dupla pegajosa, e colocando-a em uma garrafa de 100 mililitros. Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, sele a garrafa e balance-a por vários dias.

Antes de preparar os embriões, faça uma câmara de desidratação em que os embriões serão colocados antes da injeção. Para fazer isso, coloque uma parte de uma antena de 35 milímetros dentro de uma placa de Petri de 100 milímetros para fazer uma "mesa". Add Drierite, que é sulfato de cálcio anidro, ao seu redor para que a altura do Drierite não seja maior que a "mesa", e cubra.

Para começar a preparar os embriões, primeiro colecioná-los da gaiola leiga, trocando a placa de suco de uva com levedura a cada hora. Os embriões devem ser imagens cerca de duas horas após o início da coleção. Para preparar o deslizamento, coloque-o em um lado de um deslizamento de microscópio e tape os quatro cantos para baixo, para que ele não se mova.

Usando um aplicador de ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha na tampa. A cola não deve ser viscosa e deve secar em poucos segundos. Se for muito grossa, adicione mais heptano.

Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide ao lado da tampa. Com um pincel umedecido, pegue cuidadosamente os embriões da placa de suco de uva e coloque-os na fita dupla pegajosa no slide.

Em seguida, use metade de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita dupla pegajosa até que o acorde se abra. Pegue o embrião enrolando-o suavemente sobre o acorde, de modo que grude na pinça, e coloque-o sobre a cola de heptano na tampa com o lado longo do embrião paralelo ao lado longo da tampa.

Coloque de 10 a 20 embriões em uma fileira. Remova o deslizamento de cobertura e coloque-o na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a mancha em uma câmara metálica com graxa de vácuo. Por fim, cubra os embriões com óleo de halocarbono para evitar mais desidratação.

Primeiro, encontre os embriões sob um objetivo 16X. Mova os embriões para longe, e encontre a agulha sem mover o plano focal.

Para abrir a agulha, coloque a borda da tampa no campo de visão, mas não onde uma agulha estará, e baixe a agulha para o mesmo plano focal. Com muito cuidado, mova a tampa até atingir a agulha e quebre-a suavemente.

Agora, leve os embriões à vista. Abaixe a agulha no óleo, e certifique-se de obter gotas líquidas agradáveis da agulha. Mova constantemente o embrião para dentro da agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, mova o embrião para longe. Depois de todos os embriões terem sido injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal com um objetivo de 60 ou 100X.