Forberedelse af Drosophila Heart: En teknik til at studere hjertefysiologi i voksenfluen

- Anderledes end i hvirveldyr, Drosophila hjertet er en del af et åbent kredsløb. Hjertet af en voksen flyve er et rør-lignende struktur bygget af kardiomyocytter, der er forbundet til epidermis af alary muskler og indlejret i ekstracellulære matrix. Hjertet kammeret er på den bageste ende af fluen og pumper hæmolymph ind i aorta, hvorfra det strømmer ind i det åbne legeme hulrum.

I insekter tjener hæmolymphen som både blod og interstitiel væske, der bærer næringsstoffer, signalmolekyler og immunceller. Yderligere vartegn i hjertet omfatter ostia, som åbner langs røret, og intracardiac-ventiler. Pericardial celler er lokaliseret langs hjerterøret og er en del af fluens udskillelsessystem.

I et eksperimentelt hjertepræparat efterligner den kunstige hæmolymph fysiologiske forhold for at bevare vævsfunktionen. Selv om naturlig hæmolymph ikke er ansvarlig for gasudveksling, skal den kunstige hæmolymph være godt iltet for at erstatte manglen på et funktionelt trachealsystem. I det følgende eksperiment demonstrerer vi et semi-intakt hjertepræparat fra en voksenflyvning til levende billeddannelse eller elektrofysiologi.

- Før vi går i gang, forbereder vi først en kunstig hæmolymphopløsning. Denne opløsning indeholder saccharose og trehalose, som skal tilsættes til den kunstige hæmolymph fra kølelageropløsninger lige før brug for at forhindre bakteriel forurening. Bring den kunstige hæmolymph til stuetemperatur og ilt opløsningen med luft, der bobler i mindst 15 minutter.

Træk derefter flere fine kapillærer ved hjælp af en standard pipette-aftrækker, som vil være nødvendig for fjernelse af fedtlegemer i fluen.

Når alt er forberedt, skal voksne fluer bedøves. Dette kan gøres ved hjælp af kort eksponering for at flyve lur i to til fem minutter, men pas på ikke at forlade fluerne i flueluden længere end fem minutter. Kortvarig udsættelse for kulde kan også bruges til at bedøve fluer, men kuldioxid anbefales ikke, da det har længerevarende virkninger på puls og rytmiskhed.

Dernæst placeres de bedøvede fluer, dorsal side ned, i en Petri parabol belagt med et tyndt lag af vaseline. Den hydrofobiske kutikula i vingerne og kroppen skal reversably holde sig til gelé, men fluen kan flyttes, hvis det er nødvendigt. En indledende snit er lavet ved hjælp af en buet par foråret saks. Dette gøres ved at placere saks knive under benene på fluen og vinklet ned mod rygoverfladen af brystkassen nær halsen.

Hovedet, ventral nerve ledningen, og benene er fjernet med et enkelt snit. Når skåret, præparatet er derefter nedsænket i den iltede kunstige hæmolymph løsning. Brug foråret saks, den bageste spids af maven, som består af abdominal segment 7 og 8, fjernes med en enkelt cut. Dette giver adgang til at gøre laterale nedskæringer langs begge kanter af maven og tjener til at bryde forbindelsen mellem den bageste tarm og abdominal cuticle.

Sæt saksens knive ind i den lille åbning i spidsen af maven og skær neglebåndet sideværts.

Tarmen og andre abdominal organer kan normalt fjernes som en enkelt masse ved hjælp af guldsmede pincet og blid slæbebåd. Fjernelse af de indre organer afslører bankende hjerte rør, som stadig er knyttet til rygkotelet af små alary muskler og er omgivet af fedt organer. De trukket kapillærer er indsat i plast, 1/16-tommer slange knyttet til et vakuum kilde. Sugekraften er proportional med spidsen diameter, så pipetter med tips større end 40 mikron i diameter bør ikke anvendes.

Når det er oprettet, bruges dette sugesystem til at suge overskydende fedt fra omkring hjerterøret. Det kan også bruges til at fjerne luftbobler, der akkumuleres omkring neglebåndet og snavs. Ekstrem omhu skal tages for at undgå at røre hjertet selv, og fordi den bageste del af hjertet er meget skrøbelig, bør denne region undgås helt.

Om nødvendigt kan neglebåndet og det påsatte hjerte flyttes ved forsigtigt at løfte neglebåndet ud af vaseline og forsigtigt tæmme det ned igen, igen undgå enhver kontakt med hjertevævet. På dette tidspunkt skal opløsningen, der bader præparatet, erstattes med frisk, kunstig hæmolymph. Dette præparat skal have lov til at ekvilibrere i 20 til 30 minutter med iltning forud for manipulationer. Hvis præparatet skal opretholdes i mere end 60 minutter, skal det re-perfunderes med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til brug til optisk optagelse og kan re-perfunderes med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfunderes med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfunderes med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfunderes med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfused med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfused med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til optisk optagelse og kan re-perfused med frisk kunstig hæmolymph. Dette præparat er nu klar til at blive brugt til anvendes også til elektrofysiologisk registrering eller til histologiske manipulationer.