C. elegans Chemotaxis Assay: Eine Methode, um Chemosensation in Worms zu testen

Overview

Dieses Video stellt Chemotaxis in der Nematode C. elegans vor und zeigt ein Beispielprotokoll, das chemotaktische Abneigung gegen Kupfersulfat testet.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vorbereitung von Versuchsorganismen
   1. Wählen Sie 10 L4 inszenierte Nematoden pro Stamm 24 h vor Beginn des Tests, um sicherzustellen, dass Organismen junge Erwachsene sind, wenn sie getestet werden. Wählen Sie für jeden getesteten Mutanten oder Kontrollnematoden 10 L4s (10 für die Steuerung und 10 für den Assay).
      1. Pflege von L4-Organismen mit Standardmethoden für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coligesät wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie dies durch Erhöhung der Anfangsstichprobengröße(d. h. 20 Würmer statt 10) pflücken.
         HINWEIS: Verhalten ist ein angeboren variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in Dreifacharbeit für jede Sorte an drei separaten Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und Bedingungen für neuartige Stämme ein, wie im Diskussionsabschnitt hervorgehoben.
   2. Unmittelbar vor dem Test, übertragen Experimentelle Organismen auf eine Agarplatte ohne Bakterien und lassen Nematoden frei für 1 min bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen.
      1. Wenn Versuchsorganismen während der 24 h vor dem Test Kontaminationsbedingungen hatten, entsorgen Sie sie.
   3. Pipette 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte, um Würmer in ein Mikrozentrifugenrohr zu waschen.
   4. Zentrifuge bei 3.000 x g für 1 min. Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirate M9 Lösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Fügen Sie 1 ml M9 in das Wurmpellet, invertieren Rohr, um Würmer mit der Lösung zu mischen.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 noch dreimal.
      1. Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern übertragen wurden, wiederholen Sie dies insgesamt 5 Mal. Es sollten keine Bakterien auf die Kupferfutter-Rennplatten übertragen werden. Wenn Lebensmittel auf die Assayplatte übertragen werden, wird es mit der genauen Datenerfassung stören.
   6. Nach der Endwäsche, Aspirat Überstand bis 100 l M9 und das Wurmpellet bleibt.
      Achtung: Hungerbedingte Verhaltensweisen werden nach 30 min sichtbar. Daher sollten Würmer sofort von der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.
2. Vorbereitung von Assay-Platten
   1. Bereiten Sie zwei Tage vor dem Test Standard-NGM-Agarplatten vor.
      1. Wenn Teller in einer feuchten Umgebung aufbewahrt werden, machen Sie Agarplatten 3 Tage vor dem Test. Alternativ entfernen Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 h, um die richtige Trockenheit zu gewährleisten (wenn in einer sterilen Umgebung).
   2. Mit einem dicken permanenten Marker, machen Sie eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der äußeren Kante und eine andere, um eine Mittellinienbarriere zu bilden (Abbildung 1). Die Mittellinienbarriere sollte äquidistant von jeder Kante der Platte sein. Verwenden Sie ein Lineal, um präzise Messungen zu gewährleisten. Diese Leitungen dienen als Richtschnur bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Sofern E. coli vor der Kupferlösung übertragen wird, dienen diese Leitungen als Indikatoren.
   3. Saatplatte mit 50 l OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen (Abbildung 2). Die bakterielle Konzentration sollte in allen Assays konsistent bleiben; Jedoch wurde als Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede eine geringe Variabilität beobachtet.
      1. Verwenden Sie die markierten Linien an der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Vorausgesetzt, dass die Kupferlösung den Rand der Platte säumt und eine Mittellinienbarriere bildet, übertragen Sie die Bakterien, damit die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt.
   4. Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli auf sie (Abbildung 2). Diese Platten dienen dazu, die Negativkontrolle zu bewerten. Diese Platten sollten auch eine Markierung auf der einen Hälfte der Platte haben, um den ursprünglichen Übertragungsursprung zu bezeichnen.
   5. Bakterien trocknen lassen und dann über Nacht bei 37 °C brüten. Stellen Sie sicher, dass bakterielle Flecken beim Transfer in einen 37 °C-Inkubator oder Raum nicht gestört werden. Übermäßige Störungen können die Position oder Form des Lebensmittelpflasters verändern.
3. Chemotaxis Assay
   1. Vor Beginn der Testaufnahme eine 0,5 M Kupfer (II) Sulfatlösung frisch vorbereiten. Sofern pro Platte 125 l der Lösung verwendet werden, skalieren Sie dieses Volumen abhängig von der Anzahl der verwendeten Assayplatten(z. B. 5 Assayplatten, 625 l).
   2. Pipette 100 l der Kupfer (II) Sulfatlösung am Rand des Agars, um eine äußere Kupferbarriere zu schaffen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Richtschnur dienen.
   3. Pipette 25 l der Kupfer (II)-Sulfatlösung, um eine Mittellinienbarriere zu schaffen.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Kupfer (II)-Sulfatlösung nicht mit dem bakteriellen Pflaster in Berührung kommt. Verwenden Sie eine gefleckte Technik, da Streaking die Fortbewegung aufgrund von Einbuchtungen/Kratzern am Agar beeinflussen kann.
   4. Lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platte und Laborbedingungen variieren. Visuelle Überprüfung auf Trockenheit alle 5 min nach dem Transfer.
      HINWEIS: Die Kupferlösung zeigt einen blauen Ton und ist leicht identifizierbar. Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Lösung in der Nähe des Rands der Platte leicht zu tumschen, um Trockenheit zu erkennen.
   5. Pipette 20 l des Wurmpellets von der Unterseite des Rohres auf die bakterienfreie Hälfte der Assayplatte.
      1. Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Assayplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich enthalten waren, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit Halocarbonöl pflücken, um sicherzustellen, dass der Platte keine Bakterien zugesetzt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben.
         HINWEIS: Wenn während der Tests zu wenige Würmer übertragen werden, wird durch die Erhöhung des anfänglichen Stichprobenumfangs potenzielle Verluste während der Wassuren und Übertragungen verringert.
   6. Entfernen Sie überschüssiges M9 von der Platte mit einem Laborgewebe. M9 sollte nicht mit der Kupfer (II) Sulfatlösung in Berührung kommen.
      Achtung: Stellen Sie sicher, dass Würmer und die Agaroberfläche während dieses Schritts nicht beeinträchtigt werden. Bei zu harter Verwendung kann das Laborgewebe Einbuchtungen an der Agaroberfläche der Platte erzeugen und Würmer entfernen. Würmer, die versehentlich über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden.
   7. Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer nicht-flüssige Bewegungsmuster begonnen haben, starten Sie die Assay-Stoppuhr.
      1. Entfernen Sie die M9-Lösung optimal innerhalb von min. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer locomote anders, z.B. Thrashing statt sinusförmig, wenn in Flüssigkeit. Starten Sie die Assay-Stopp-Uhr, sobald jeder der Experimentellen Organismen aufhört zu dreschen.
   8. Überprüfen Sie alle 30 min die Kontrollplatten.
      1. Für die Assay-Platten mit bakteriellen Flecken, positiv bewerten Organismen, wenn sie das Nahrungspflaster über einen Zeitraum von 4 h erreichen. Bei den negativen Kontrollplatten werden Organismen positiv bewertet, wenn sie die Barriere überschritten haben.

Representative Results

Abbildung 1: Eine visuelle Darstellung von Markierungen, um die Platzierung der Kupferlösung auf der Unterseite einer 5 cm Petrischale anzuzeigen. Diese Indikationen werden verwendet, um sicherzustellen, dass die Teile der Platte angemessen vermessen wurden und dienen als Richtschnur bei der Übertragung des bakteriellen Pflasters und dann der Kupferlösung auf die Agaroberfläche.

Abbildung 2: Die 5 cm Petrischale ist in zwei Abschnitte für auf und neben Food Assay Platten unterteilt und ein bakterieller Rasen wird in der Mitte einer dieser Abschnitte für die On-Food-Platte gebildet. Das Lebensmittelpflaster sollte nicht mit der Prüfmasse in Berührung kommen, die die Ränder der Platte auskundet und eine Mittellinienbarriere bildet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M