斑马鱼光遗传学：激活转基因躯体感官神经元研究拉瓦尔行为反应

Overview

该视频通过激活转基因躯体感官神经元和使用高速摄像机记录引起的行为反应来描述光遗传技术。

Protocol

1. 行为实验的拉瓦山

1. 在ddH2O中制作1.5%的低熔性蔗糖，并储存在42°C的热块中，以防止其凝固。
2. 使用玻璃巴斯德移液器，将其中一只预先筛选的幼虫转移到一管1.5%的低熔体中，用尽可能少的蓝色/胚胎水。
3. 将幼虫在一滴糖中转移到一个小的培养皿上。
4. 在解剖显微镜下，位置幼虫会反向上升。
5. 当阿加罗斯凝固后，用细剃须刀刀片（#11手术刀）切开阿加罗斯，在整个幼虫周围留下一个楔子。
6. 在蛋黄的两边切两个对角线：小心不要划破幼虫。
7. 用胚胎/蓝水填充玫瑰周围的区域。
8. 将阿加罗斯从幼虫的躯干和尾部拉开（图1）。

2 .准备高速相机和成像软件

1. 将高速摄像机安装到解剖范围上。
2. 将相机连接到计算机。
3. 打开电脑。
4. 打开高速摄像机。
5. 打开视频/成像软件（我们使用 AOS 成像软件，并将在这里描述使用它的程序，但其他成像软件同样可接受）。
6. 相应地调整摄像机设置（即 每秒 1，000 帧（fps）、50% 触发缓冲区或其他首选设置）。
7. 开始录制。

3. 使用 473 nm 激光激活单个神经元

1. 附加刺激器、激光和光缆。
2. 打开刺激器。
3. 将刺激器设置为最大 5 伏特，脉搏持续时间为 5 msec。
4. 根据制造商的说明打开激光。
5. 使用解剖显微镜将光缆尖端定位在具有 ChEF-tdTomato 表达（图 1）的神经元细胞体附近。
6. 传递蓝光脉冲以激活感官神经元。
7. 使用高速摄像机以每秒 500 或 1，000 帧的速度记录行为。
8. 根据需要重复实验，每次激活之间等待 1 分钟以避免习惯。（我们记录每个神经元至少三个响应）。
9. 为了释放幼虫，用钳子撬开幼虫，小心不要伤害动物。这种动物可以进一步发展，程序可以在较老的阶段重复，以描述行为的发展。胚胎还可以重新安装，用于活化细胞的高分辨率共焦成像，以将行为与细胞结构相关联，如下所述。
10. 将幼虫转移到培养板与新鲜的蓝色/胚胎水。我们使用24井板来跟踪个别幼虫。

Representative Results

图1。参与幼虫触摸反应的斑马鱼幼虫和代表性神经元的图表。 斑马鱼幼虫部分安装在1.5%的低熔岩（以围绕幼虫的罗斯特拉部分的虚线表示）。三叉神经元（在头部）和罗汉胡子神经元（在树干中）被描绘成红色。毛特纳细胞由幼虫的虚线勾勒出来。光缆（白色）位于RB神经元细胞体上。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent