Overview
このビデオでは、遺伝子組み換え体質体性感覚ニューロンを活性化し、高速ビデオカメラで行動応答を記録することによって光遺伝学的手法について説明します。
Protocol
行動実験のための1.マウント・ラーヴェ
- ddH2Oで1.5%低溶融アガロースを作り、固化を防ぐために42°Cのヒートブロックに保管してください。
- ガラス製のパスツールピペットを使用して、スクリーニング済みの幼虫の1つを、できるだけ少ない青/胚水で1.5%低メルトアガロースのチューブに移します。
- 小さなペトリ皿にアガロースの滴で幼虫を移します。
- 解剖顕微鏡の下で、幼虫を後に置く。
- アガロースが固まったら、幼虫全体の周りに寒天のくさびを残して、薄いカミソリの刃(#11メス)でアガロースを切り取ります。
- 黄身の両側に2つの斜めのカットを行います。幼虫をかじらないで注意してください。
- アガロースの周囲の部分を胚/青い水で満たします。
- 幼虫の幹と尾からアガロースを引き離す(図1)。
2 .高速カメラとイメージングソフトウェアの準備
- 高速カメラを解剖スコープに取り付けます。
- カメラをコンピュータに接続します。
- コンピュータの電源を入れます。
- 高速カメラをオンにします。
- オープンビデオ/イメージングソフトウェア(私たちはAOSイメージングソフトウェアを使用し、ここでそれを使用するための手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェアも同様に受け入れられます)。
- カメラの設定を適宜調整します(1 秒あたり1,000フレーム(fps)、50%トリガーバッファ、またはその他の優先設定)。
- 録音を開始します。
3. 473 nmレーザーを使用して単一のニューロンを活性化する
- 刺激装置、レーザーおよび光学ケーブルを取り付ける。
- 刺激装置をオンにします。
- 刺激装置を最大5ボルト、パルス持続時間を5ミリ秒に設定します。
- メーカーの指示に従ってレーザーをオンにします。
- ChEF-tdTomato発現を有するニューロンの細胞体近くに光ケーブルの先端を配置するために解剖顕微鏡を使用する(図1)。
- 青色光のパルスを供給し、感覚ニューロンを活性化します。
- 500 または 1,000 フレーム/秒に設定された高速カメラを使用して動作を記録します。
- 慣れにならないように、各活性化の間に1分待って、所望に応じて実験を繰り返す。(ニューロンごとに最低3つの応答を記録します)。
- 幼虫を解放するには、動物を傷つけないように注意して、鉗子でアガロースを引き離します。この動物はさらに発達させることができ、処置は行動の発達を特徴付けるために古い段階で繰り返すことができる。胚はまた、以下に説明するように、細胞構造と行動を相関させるために活性化細胞の高解像度共焦点イメージングのために再マウントすることができる。
- 幼虫を新鮮な青/胚水で培養プレートに移します。私たちは、個々の幼虫を追跡するために24ウェルプレートを使用しています。
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Representative Results
図 1.幼虫の触動に関与するシブラフィッシュ幼虫および代表的なニューロンの図。 ゼブラフィッシュ幼虫は、部分的に1.5%低溶融アガロース(幼虫の鼻部を囲む破線で表される)に取り付けられました。三叉ニューロン(頭)とロホンひげニューロン(体幹)は赤で描かれています。マウトナー細胞は幼虫の破線で輪郭を描いている。光学ケーブル(白)は、RBニューロン細胞体の上に配置されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
