Overview
Denna video beskriver optogenetiska tekniker genom att aktivera genetiskt modifierade somatosensory nervceller och inspelning framkallade beteendemässiga svar med en höghastighets videokamera.
Protocol
1. Montera larver för beteendeexperiment
- Gör 1,5% låg smältagarosa i ddH2O och förvara i ett 42 °C värmeblock för att förhindra att det stelna.
- Använd en pastörpipett i glas och överför en av de förskärmade larverna till ett rör med 1,5 % låg smältagarosa med så lite blått/embryovatten som möjligt.
- Överför larver i en droppe agarose på en liten Petri-maträtt.
- Under ett dissekerande mikroskop, placera larva dorsal upp.
- När agarose har stelnat, skär bort agarose med ett tunt rakblad (#11 skalpell), lämnar en kil av agar runt hela larven.
- Gör två diagonala snitt på vardera sidan av äggulan; Var försiktig så att du inte hackar larven.
- Fyll området kring agarosen med embryo/blått vatten.
- Dra bort agaros från larvens bagageutrymme och svans (figur 1).
2 . Förbereda programvara för höghastighetskameror och bildbilder
- Montera höghastighetskameran på dissekeringsomfånget.
- Anslut kameran till datorn.
- Slå på datorn.
- Slå på höghastighetskameran.
- Öppen programvara för video/bildbehandling (Vi använder AOS bildbehandlingsprogram och kommer att beskriva procedurer för att använda den här, men annan bildprogramvara är lika acceptabel).
- Justera kamerainställningarna ienlighet därmed ( dvs. 1 000 bildrutor per sekund (fps), 50 % utlösarbuffert eller andra önskade inställningar).
- Börja spela in.
3. Aktivera enstaka nervceller med en 473 nm laser
- Fäst stimulator, laser och optisk kabel.
- Slå på stimulatorn.
- Ställ in stimulatorn på högst 5 volt och en pulslängd på 5 msec.
- Slå på laser enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd ett dissekerande mikroskop för att placera spetsen på den optiska kabeln nära cellkroppen på en neuron med ChEF-tdTomato-uttryck (Figur 1).
- Leverera puls av blått ljus för att aktivera sensorisk neuron.
- Spela in beteende med en höghastighetskamera inställd på 500 eller 1 000 bildrutor per sekund.
- Upprepa experimentet efter önskemål och vänta 1 minut mellan varje aktivering för att undvika tillvänjning. (Vi registrerar minst tre svar för varje neuron).
- För att frigöra larver, bänd isär agarose med tång, var försiktig så att du inte skadar djuret. Detta djur kan tillåtas att utvecklas ytterligare och proceduren kan upprepas i ett äldre skede för att karakterisera utvecklingen av beteendet. Embryot kan också återmonteras för högupplöst konfokal avbildning av den aktiverade cellen för att korrelera beteendet med cellstrukturen, enligt beskrivningen nedan.
- Överför larven till odlingsplattan med färskt blått/embryovatten. Vi använder en 24-brunnsplatta för att hålla reda på enskilda larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Diagram över en monterad zebrafisk larva och representativa nervceller inblandade i larv beröring svar. Zebrafisklarver monterades delvis i 1,5% låg smältagarosa (representerad av streckade linjer som omger rostraldelen av larven). En trigeminal neuron (i huvudet) och en Rohon-Beard neuron (i stammen) avbildas i rött. Mauthnerceller skisseras av streckade linjer i larven. Den optiska kabeln (vit) visas placerad över RB-neuroncellkroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
