Overview
Questo video descrive le tecniche optogenetiche attivando neuroni somatosensoriali geneticamente modificati e registrando la risposta comportamentale suscitata con una videocamera ad alta velocità.
Protocol
1. Montare le larve per esperimenti di comportamento
- Fare l'1,5% di agarosio a bassa fusione in ddH2O e conservare in un blocco di calore a 42 °C per evitare che si solidizzi.
- Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, trasferire una delle larve pre-schermate in un tubo dell'1,5% di agarosio a bassa fusione con la meno acqua blu / embrionale possibile.
- Trasferire le larve in una goccia di agarosio su una piccola piastra di Petri.
- Al microscopio sezionato, posizionare la larva dorsale verso l'alto.
- Quando l'agarosio si è solidificato, tagliare l'agarosio con una sottile lama di rasoio (#11 bisturi), lasciando un cuneo di agar intorno all'intera larva.
- Effettuare due tagli diagonali su entrambi i lati del tuorlo; fare attenzione a non nickare la larva.
- Riempire l'area circostante l'agarosio con acqua embrionale/blu.
- Estrarre l'agarosio dal tronco e dalla coda della larva (Figura 1).
2 . Preparare un software per fotocamere e immagini ad alta velocità
- Montare la telecamera ad alta velocità sull'ambito di sezionamento.
- Collegare la fotocamera al computer.
- Accendere il computer.
- Accendi la telecamera ad alta velocità.
- Software di imaging/video aperto (utilizziamo il software di imaging AOS e descriveremo le procedure per utilizzarlo qui, ma altri software di imaging sono ugualmente accettabili).
- Regola le impostazioni dellafotocamera di conseguenza (ad esempio 1.000 fotogrammi al secondo (fps), buffer trigger del 50% o altre impostazioni preferite).
- Avviare la registrazione.
3. Attivare singoli neuroni utilizzando un laser a 473 nm
- Collegare stimolatore, laser e cavo ottico.
- Accendi lo stimolatore.
- Impostare lo stimolatore su un massimo di 5 Volt e una durata dell'impulso di 5 msec.
- Accendere il laser secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare un microscopio sezionato per posizionare la punta del cavo ottico vicino al corpo cellulare di un neurone con espressione ChEF-tdTomato (Figura 1).
- Fornire impulso di luce blu per attivare il neurone sensoriale.
- Registra il comportamento utilizzando una fotocamera ad alta velocità impostata su 500 o 1.000 fotogrammi al secondo.
- Ripetere l'esperimento come desiderato, in attesa di 1 minuto tra ogni attivazione per evitare l'assuezione. (Registriamo un minimo di tre risposte per ogni neurone).
- Per rilasciare le larve, fare a pezzi l'agarosio con pinzi, facendo attenzione a non ferire l'animale. Questo animale può essere permesso di svilupparsi ulteriormente e la procedura può essere ripetuta in una fase più vecchia per caratterizzare lo sviluppo del comportamento. L'embrione può anche essere rimontato per l'imaging confocale ad alta risoluzione della cellula attivata per correlare il comportamento con la struttura cellulare, come descritto di seguito.
- Trasferire la larva nel piatto di coltura con acqua blu / embrionale fresca. Usiamo una piastra da 24 po 'per tenere traccia delle singole larve.
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Representative Results
Figura 1. Diagramma di una larva di zebrafish montata e neuroni rappresentativi coinvolti nella risposta del tocco larvale. Le larve di zebrafish erano parzialmente montate in agarosio a bassa fusione dell'1,5% (rappresentato da linee tratteggiate che circondano la porzione rostrale della larva). Un neurone trigeminale (nella testa) e un neurone Rohon-Barba (nel tronco) sono raffigurati in rosso. Le cellule di Mauthner sono delineate da linee tratteggiate nella larva. Il cavo ottico (bianco) è mostrato posizionato sopra il corpo cellulare del neurone RB.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
