Overview
يصف هذا الفيديو التقنيات البصرية من خلال تنشيط الخلايا العصبية الحسية سوماتوسونسي المعدلة وراثيا وتسجيل أثار استجابة سلوكية مع كاميرا فيديو عالية السرعة.
Protocol
1. جبل اليرقات للتجارب السلوكية
- جعل 1.5٪ agarose ذوبان منخفضة في ddH2O وتخزينها في كتلة الحرارة 42 درجة مئوية لمنعها من ترسيخ.
- باستخدام ماصة باستور زجاجية ، قم بنقل واحدة من اليرقات التي تم فحصها مسبقا إلى أنبوب منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ مع أقل قدر ممكن من الماء الأزرق / الجنين.
- نقل اليرقات في قطرة من الآجروز على طبق بيتري صغير.
- تحت مجهر تشريح ، ضع اليرقة الظهرية.
- عندما تتوطد agarose ، اقطع الآغروز بشفرة حلاقة رقيقة (#11 مشرط) ، تاركا إسفينا من أجار حول اليرقة بأكملها.
- جعل اثنين من التخفيضات قطري على جانبي صفار. الحرص على عدم اليرقة.
- ملء المنطقة المحيطة agarose مع الجنين / الماء الأزرق.
- سحب agarose بعيدا عن الجذع والذيل من اليرقة (الشكل 1).
2 . إعداد كاميرا عالية السرعة وبرامج التصوير
- جبل كاميرا عالية السرعة على نطاق تشريح.
- توصيل الكاميرا بالكمبيوتر.
- قم بتشغيل الكمبيوتر.
- تشغيل كاميرا عالية السرعة.
- فتح برامج الفيديو / التصوير (نحن نستخدم برنامج التصوير AOS وسوف تصف إجراءات لاستخدامه هنا، ولكن برامج التصوير الأخرى مقبولة على قدم المساواة).
- ضبط إعدادات الكاميرا وفقا لذلك(أي 1000 لقطة في الثانية (إطارا في الثانية) ، 50 ٪ الزناد العازلة أو غيرها من الإعدادات المفضلة).
- بدء التسجيل.
3. تنشيط الخلايا العصبية واحدة باستخدام ليزر 473 نانومتر
- إرفاق المحفز والليزر والكابلات البصرية.
- تشغيل محفز.
- تعيين محفز إلى حد أقصى 5 فولت ومدة نبض 5 msec.
- تشغيل الليزر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدام المجهر تشريح لوضع غيض من كابل البصرية بالقرب من جسم الخلية من الخلايا العصبية مع التعبير ChEF-tdTomato (الشكل 1).
- تقديم نبض الضوء الأزرق لتنشيط الخلايا العصبية الحسية.
- تسجيل السلوك باستخدام كاميرا عالية السرعة تعيين في 500 أو 1000 لقطة في الثانية الواحدة.
- كرر التجربة حسب الرغبة، والانتظار 1 دقيقة بين كل تفعيل لتجنب التعود. (نسجل ما لا يقل عن ثلاثة ردود لكل خلية عصبية).
- لإطلاق اليرقات ، نقب عن الآجروز مع ملقط ، مع الحرص على عدم إصابة الحيوان. ويمكن السماح لهذا الحيوان لتطوير مزيد من ويمكن تكرار الإجراء في مرحلة أقدم لتوصيف تطور السلوك. يمكن أيضا إعادة تركيب الجنين للتصوير البؤري عالي الدقة للخلية المنشطة لربط السلوك بالبنية الخلوية ، كما هو موضح أدناه.
- نقل اليرقات إلى لوحة الثقافة مع المياه الزرقاء / الجنين الطازجة. نحن نستخدم لوحة من 24 بئرا لتتبع اليرقات الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن رسم تخطيطي ليرقات حمار وحشي محمولة وخلايا عصبية تمثيلية تشارك في استجابة اللمس اليرقات. تم تركيب يرقات حمار وحشي جزئيا في أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ (ممثلة بخطوط متقطعة تحيط بالجزء الوردي من اليرقة). يتم تصوير خلية عصبية ثلاثية البروم (في الرأس) وخلية عصبية روهون بيرد (في الجذع) باللون الأحمر. يتم تحديد خلايا ماوثنر بواسطة خطوط متقطعة في اليرقة. يظهر الكابل البصري (أبيض) في وضع فوق جسم الخلية العصبية RB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
