Overview
Dieses Video beschreibt optogenetische Techniken, indem genetisch veränderte somatosensorische Neuronen aktiviert und eine Verhaltensreaktion mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet wird.
Protocol
1. Mount Larven für Verhaltensexperimente
- Machen Sie 1,5% niedrige Schmelzagarose in ddH2O und lagern Sie in einem 42 °C Wärmeblock, um eine Erstarrung zu verhindern.
- Mit einer gläsernen Pasteurpipette eine der vorgeschirmten Larven in ein Rohr mit 1,5% niedriger Schmelzagarose mit möglichst wenig blau/embryondem Wasser übertragen.
- Larven in einem Tropfen Agarose auf eine kleine Petrischale übertragen.
- Unter einem Sezieren Mikroskop, Position Larve dorsal nach oben.
- Wenn Agarose erstarrt ist, schneiden Sie die Agarose mit einer dünnen Rasierklinge (#11 Skalpell) ab und hinterlassen Sie einen Keil von Agar um die gesamte Larve.
- Machen Sie zwei diagonale Schnitte auf beiden Seiten des Dotters; achten Sie darauf, die Larve nicht zu nicken.
- Füllen Sie den Bereich um die Agarose mit embryonalem/blauem Wasser.
- Ziehen Sie Agarose weg vom Stamm und Schwanz der Larve (Abbildung 1).
2 . Vorbereiten von Hochgeschwindigkeitskameras und Bildverarbeitungssoftware
- Montieren Sie Die Hochgeschwindigkeitskamera auf die Sezieren von Bereichen.
- Schließen Sie die Kamera an den Computer an.
- Schalten Sie den Computer ein.
- Schalten Sie die Hochgeschwindigkeitskamera ein.
- Offene Video-/Imaging-Software (Wir verwenden AOS-Bildgebungssoftware und beschreiben hier Verfahren für die Verwendung, aber andere Bildverarbeitungssoftware ist ebenso akzeptabel).
- Passen Sie die Kameraeinstellungen entsprechend an(d. h. 1.000 Frames pro Sekunde (fps), 50% Triggerpuffer oder andere bevorzugte Einstellungen).
- Starten Sie die Aufnahme.
3. Aktivieren Sie Einzelne Neuronen mit einem 473 nm Laser
- Anbringen von Stimulator, Laser und Optischem Kabel.
- Stimulator einschalten.
- Einstellen Sie den Stimulator auf maximal 5 Volt und eine Pulsdauer von 5 msec.
- Schalten Sie den Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
- Verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe des Zellkörpers eines Neurons mit ChEF-tdTomato-Expression zu positionieren (Abbildung 1).
- Liefern Sie einen Puls des blauen Lichts, um sensorisches Neuron zu aktivieren.
- Zeichnen Sie das Verhalten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf, die auf 500 oder 1.000 Bilder pro Sekunde eingestellt ist.
- Wiederholen Sie das Experiment wie gewünscht, warten Sie 1 min zwischen jeder Aktivierung, um Gewöhnung zu vermeiden. (Wir erfassen mindestens drei Antworten für jedes Neuron).
- Um Larven freizusetzen, hebeln Sie Agarose mit Zange auseinander und achten darauf, das Tier nicht zu verletzen. Dieses Tier kann sich weiterentwickeln und das Verfahren kann in einem älteren Stadium wiederholt werden, um die Entwicklung des Verhaltens zu charakterisieren. Der Embryo kann auch für eine hochauflösende konfokale Bildgebung der aktivierten Zelle wieder montiert werden, um das Verhalten mit der Zellstruktur zu korrelieren, wie unten beschrieben.
- Larven mit frischem Blau/Embryowasser auf Kulturplatte übertragen. Wir verwenden eine 24-Well-Platte, um einzelne Larven zu verfolgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1. Diagramm einer montierten Zebrafischlarve und repräsentativer Neuronen, die an der Larvenberührungsreaktion beteiligt sind. Zebrafischlarven wurden teilweise in 1,5% niedriger Schmelzagarose montiert (dargestellt durch gestrichelte Linien, die den rostralen Teil der Larve umgeben). Ein Trigeminusneuron (im Kopf) und ein Rohon-Beard-Neuron (im Rumpf) sind rot dargestellt. Mauthner-Zellen werden durch gestrichelte Linien in der Larve umrissen. Das optische Kabel (weiß) wird über dem KÖRPER der RB-Neuronenzellen positioniert angezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
