Optogenética del pez cebra: Activación de la neurona somatosensorial modificada genéticamente para estudiar las respuestas conductuales larvarias

Overview

Este video describe técnicas optogenéticas mediante la activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente y la grabación de respuesta conductual provocada con una cámara de vídeo de alta velocidad.

Protocol

1. Monte larvas para experimentos de comportamiento

1. Hacer 1.5% baja derretimiento agarose en ddH2O y almacenar en un bloque de calor de 42 ° C para evitar que se solidifique.
2. Usando una pipeta pasteur de vidrio, transfiera una de las larvas pre-examinadas a un tubo de 1,5% de baja agarose derretida con el menor agua azul / embrión como sea posible.
3. Transfiera larvas en una gota de agarose en una pequeña placa de Petri.
4. Bajo un microscopio diseccionador, coloque la larva dorsal hacia arriba.
5. Cuando la agarose se haya solidificado, corta la agarose con una fina cuchilla de afeitar (#11 bisturí), dejando una cuña de agar alrededor de toda la larva.
6. Hacer dos cortes diagonales a ambos lados de la yema; tener cuidado de no robar la larva.
7. Llene el área que rodea la agarose con agua embrión/azul.
8. Tire de la agarose lejos del tronco y la cola de la larva (Figura 1).

1 M Preparar la cámara de alta velocidad y el software de imágenes

1. Monte la cámara de alta velocidad en el alcance de disección.
2. Conecte la cámara al ordenador.
3. Encienda la computadora.
4. Encienda la cámara de alta velocidad.
5. Abra el software de vídeo/imágenes (Utilizamos software de imágenes AOS y describiremos los procedimientos para usarlo aquí, pero otro software de imágenes es igualmente aceptable).
6. Ajuste la configuración de la cámara en consecuencia(es decir, 1.000 fotogramas por segundo (fps), 50% búfer de disparo u otros ajustes preferidos).
7. Comience a grabar.

3. Activar neuronas individuales usando un láser de 473 nm

1. Conecte el estimulador, el láser y el cable óptico.
2. Enciende el estimulador.
3. Ajuste el estimulador a un máximo de 5 Voltios y una duración del pulso de 5 msec.
4. Encienda el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Utilice un microscopio diseccionador para colocar la punta del cable óptico cerca del cuerpo celular de una neurona con expresión ChEF-tdTomato (Figura 1).
6. Entregar pulso de luz azul para activar la neurona sensorial.
7. Registre el comportamiento utilizando una cámara de alta velocidad establecida en 500 o 1.000 fotogramas por segundo.
8. Repita el experimento como desee, esperando 1 minuto entre cada activación para evitar la habituación. (Registramos un mínimo de tres respuestas para cada neurona).
9. Para liberar larvas, se desgarraba con fórceps, teniendo cuidado de no herir al animal. Se puede permitir que este animal se desarrolle más y el procedimiento se puede repetir en una etapa más antigua para caracterizar el desarrollo del comportamiento. El embrión también se puede volver a montar para obtener imágenes confocales de alta resolución de la célula activada para correlacionar el comportamiento con la estructura celular, como se describe a continuación.
10. Transfiera larvas a la placa de cultivo con agua azul fresca/embrión. Usamos una placa de 24 pozos para realizar un seguimiento de las larvas individuales.

Representative Results

Figura 1. Diagrama de una larva de pez cebra montada y neuronas representativas implicadas en la respuesta táctil larvaria. Las larvas de pez cebra se montaron parcialmente en 1,5% de agarose derretida baja (representada por líneas discontinuas que rodean la porción rostral de la larva). Una neurona trigémino (en la cabeza) y una neurona Rohon-Beard (en el tronco) se representan en rojo. Las células mauthner son delineadas por líneas discontinuas en la larva. El cable óptico (blanco) se muestra colocado sobre el cuerpo de la célula de la neurona RB.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent