Overview
Denne video beskriver optogenetiske teknikker ved at aktivere genetisk modificerede somatosensoriske neuroner og optage fremkaldt adfærdsmæssig respons med et højhastighedsvideokamera.
Protocol
1. Mount Larver til adfærdseksperimenter
- Lav 1,5% lavt smelte agarose i ddH2O og opbevar i en 42 °C varmeblok for at forhindre det i at størkne.
- Ved hjælp af et glas Pasteur pipette overføres en af de forskærmede larver til et rør på 1,5% lavt smeltevand med så lidt blåt / embryonvand som muligt.
- Overfør larver i en dråbe agarose på en lille petriskål.
- Under et dissekerende mikroskop, position larve dorsal op.
- Når agarose er størknet, skæres væk agarose med en tynd barberblad (#11 skalpel), forlader en kile af agar omkring hele larven.
- Foretag to diagonale udskæringer på hver side af æggeblommen; pas på ikke at hugge larven.
- Fyld området omkring agarose med embryo / blåt vand.
- Træk agarose væk fra larvens bagagerum og hale (Figur 1).
2 . Forbered højhastighedskamera- og billedbehandlingssoftware
- Monter højhastighedskameraet på dissekeringsområdet.
- Tilslut kameraet til computeren.
- Tænd computeren.
- Tænd for højhastighedskameraet.
- Åben video / billedbehandling software (Vi bruger AOS billedbehandling software og vil beskrive procedurer for at bruge det her, men andre billedbehandling software er lige så acceptabelt).
- Juster kameraindstillingerne i overensstemmelse hermed(dvs. 1.000 billeder pr. sek. (fps), 50 % udløserbuffer eller andre foretrukne indstillinger).
- Begynd at optage.
3. Aktiver enkelt neuroner ved hjælp af en 473 nm laser
- Vedhæft stimulator, laser og optisk kabel.
- Tænd stimulator.
- Indstil stimulator til maksimalt 5 volt og en pulsvarighed på 5 msec.
- Tænd for laser i henhold til producentens anvisninger.
- Brug et dissekerende mikroskop til at placere spidsen af det optiske kabel i nærheden af cellekroppen af en neuron med ChEF-tdTomato-udtryk (Figur 1).
- Levere puls af blåt lys til at aktivere sensoriske neuron.
- Optag funktionsmåden ved hjælp af et højhastighedskamera, der er indstillet til 500 eller 1.000 billeder pr. sek.
- Gentag eksperimentet som ønsket, venter 1 minut mellem hver aktivering for at undgå tilvænning. (Vi registrerer mindst tre svar for hver neuron).
- For at frigive larver skal du lirke agarose fra hinanden med pincet og passe på ikke at skade dyret. Dette dyr kan få lov til at udvikle sig yderligere, og proceduren kan gentages på et ældre stadium for at karakterisere udviklingen af adfærden. Embryoet kan også monteres igen til konfokal billeddannelse i høj opløsning af den aktiverede celle for at korrelere adfærd med cellulær struktur, som beskrevet nedenfor.
- Larven overføres til kulturpladen med frisk blåt/embryonvand. Vi bruger en 24-brønds plade til at holde styr på individuelle larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Diagram over en monteret zebrafisk larve og repræsentative neuroner involveret i larve touch respons. Zebrafisk larver blev delvist monteret i 1,5% lav smelte agarose (repræsenteret ved stiplede linjer omkring larvens rostrale del). En trigeminus neuron (i hovedet) og en Rohon-Beard neuron (i bagagerummet) er afbildet med rødt. Mauthner celler er skitseret af stiplede linjer i larven. Den optiske kabel (hvid) er vist placeret over RB neuron celle kroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue | ||
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
