Zebravis optogenetica: het activeren van genetisch gemodificeerd somatosensorisch neuron om larvale gedragsreacties te bestuderen

Overview

Deze video beschrijft optogenetische technieken door genetisch gemodificeerde somatosensorische neuronen te activeren en een opgewekte gedragsrespons op te nemen met een high-speed videocamera.

Protocol

1. Monteer larven voor gedragsexperimenten

1. Maak 1,5% lage smeltagarose in ddH2O en bewaar in een hitteblok van 42 °C om te voorkomen dat het stolt.
2. Breng met behulp van een glazen Pasteur pipet een van de voorgescreende larven over in een buis van 1,5% lage smelting met zo min mogelijk blauw/embryowater.
3. Breng larven in een druppel agarose over op een kleine petrischaal.
4. Plaats onder een ontleedmicroscoop de larve dorsaal omhoog.
5. Wanneer agarose is gestold, snijdt u de agarose weg met een dun scheermesje (#11 scalpel), waardoor een wig van agar rond de hele larve achterblijft.
6. Maak twee diagonale sneden aan weerszijden van de dooier; zorg ervoor dat je de larve niet steelt.
7. Vul het gebied rond de agarose met embryo/blauw water.
8. Trek agarose weg van de stam en staart van de larve (Figuur 1).

2 . Maak high-speed camera- en beeldvormingssoftware klaar

1. Monteer de hogesnelheidscamera op het ontleden van het bereik.
2. Sluit de camera aan op de computer.
3. Schakel de computer in.
4. Zet de hogesnelheidscamera aan.
5. Open video/imaging software (We gebruiken AOS imaging software en zullen hier procedures beschrijven voor het gebruik ervan, maar andere imaging software is even acceptabel).
6. Pas de camera-instellingen dienovereenkomstig aan(d.w.z. 1.000 frames per seconde (fps), 50% triggerbuffer of andere voorkeursinstellingen).
7. Begin met opnemen.

3. Activeer enkele neuronen met behulp van een 473 nm laser

1. Bevestig stimulator, laser en optische kabel.
2. Zet de stimulator aan.
3. Stel de stimulator in op maximaal 5 Volt en een pulsduur van 5 msec.
4. Schakel de laser in volgens de instructies van de fabrikant.
5. Gebruik een ontleedmicroscoop om de punt van de optische kabel in de buurt van het cellichaam van een neuron met ChEF-tdTomato-expressie te plaatsen (Figuur 1).
6. Lever puls van blauw licht om sensorische neuron te activeren.
7. Neem gedrag op met een hogesnelheidscamera met 500 of 1.000 frames per seconde.
8. Herhaal het experiment naar wens en wacht 1 minuut tussen elke activering om gewennbaarheid te voorkomen. (We registreren minimaal drie reacties voor elk neuron).
9. Om larven vrij te laten, wring je agarose uit elkaar met een tang, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het dier niet gewond wordt. Dit dier kan zich verder ontwikkelen en de procedure kan in een ouder stadium worden herhaald om de ontwikkeling van het gedrag te karakteriseren. Het embryo kan ook opnieuw worden gemonteerd voor confocale beeldvorming met hoge resolutie van de geactiveerde cel om gedrag te correleren met de cellulaire structuur, zoals hieronder beschreven.
10. Breng de larve over op de kweekplaat met vers blauw/embryowater. We gebruiken een 24-put plaat om individuele larven bij te houden.

Representative Results

Figuur 1. Diagram van een gemonteerde zebravislarve en representatieve neuronen die betrokken zijn bij de larvale aanraakreactie. Zebravislarven werden gedeeltelijk gemonteerd in 1,5% lage smeltagarose (vertegenwoordigd door stippellijnen rond het rostrale deel van de larve). Een trigeminusneuron (in het hoofd) en een Rohon-Beard neuron (in de romp) zijn in het rood afgebeeld. Mauthner-cellen worden omlijnd door stippellijnen in de larve. De optische kabel (wit) wordt over het rb neuron cellichaam geplaatst.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent