Zebrafish Optogentics: Ativando neurônio somatossensorial geneticamente modificado para estudar respostas comportamentais larvais

Overview

Este vídeo descreve técnicas optogenéticas ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados e registrando resposta comportamental provocada com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Protocol

1. Monte Larvas para Experimentos comportamentais

1. Faça 1,5% de baixa agarose de derretimento no ddH2O e armazene em um bloco de calor de 42 °C para evitar que se solidifique.
2. Usando uma pipeta pasteur de vidro, transfira uma das larvas pré-rastreadas para um tubo de 1,5% de baixa agarose de derretimento com o mínimo de água azul/embrião possível.
3. Transfira larvas em uma gota de agarose em uma pequena placa de Petri.
4. Sob um microscópio dissecando, posicione a larva dorsal.
5. Quando a agarose se solidificar, corte a agarose com uma lâmina de barbear fina (#11 bisturi), deixando uma cunha de ágar ao redor de toda a larva.
6. Faça dois cortes diagonais em ambos os lados da gema; tome cuidado para não cortar a larva.
7. Encha a área ao redor da agarose com embrião/água azul.
8. Puxe agarose para longe do tronco e cauda da larva(Figura 1).

2 . Prepare o software de câmera e imagem de alta velocidade

1. Monte a câmera de alta velocidade no escopo de dissecação.
2. Conecte a câmera ao computador.
3. Ligue o computador.
4. Ligue a câmera de alta velocidade.
5. Software de vídeo/imagem aberto (usamos o software de imagem AOS e descreveremos procedimentos para usá-lo aqui, mas outros softwares de imagem são igualmente aceitáveis).
6. Ajuste as configurações da câmera de acordo(ou seja, 1.000 quadros por segundo (fps), buffer de gatilho de 50% ou outras configurações preferenciais).
7. Comece a gravar.

3. Ativar neurônios únicos usando um laser de 473 nm

1. Anexar estimulador, laser e cabo óptico.
2. Ligue o estimulador.
3. Defina o estimulador a um máximo de 5 Volts e uma duração de pulso de 5 mseg.
4. Ligue o laser de acordo com as instruções do fabricante.
5. Use um microscópio dissecando para posicionar a ponta do cabo óptico perto do corpo celular de um neurônio com expressão ChEF-tdTomato(Figura 1).
6. Entregue pulso de luz azul para ativar o neurônio sensorial.
7. Regisso comportamento de registro usando uma câmera de alta velocidade definida em 500 ou 1.000 quadros por segundo.
8. Repita o experimento conforme desejado, esperando 1 min entre cada ativação para evitar a habitação. (Registramos um mínimo de três respostas para cada neurônio).
9. Para liberar larvas, se agarose com fórceps, tomando cuidado para não ferir o animal. Este animal pode ser permitido desenvolver-se ainda mais e o procedimento pode ser repetido em um estágio mais antigo para caracterizar o desenvolvimento do comportamento. O embrião também pode ser remontado para imagens confocal de alta resolução da célula ativada para correlacionar o comportamento com a estrutura celular, conforme descrito abaixo.
10. Transfira larva para placa de cultura com água azul/embrião fresco. Usamos uma placa de 24 poços para controlar larvas individuais.

Representative Results

Figura 1. Diagrama de uma larva de zebrafish montada e neurônios representativos envolvidos na resposta ao toque larval. As larvas de zebrafish foram parcialmente montadas em 1,5% de baixa agarose de derretimento (representada por linhas tracejadas ao redor da porção rostral da larva). Um neurônio trigêmeo (na cabeça) e um neurônio Rohon-Beard (no tronco) são retratados em vermelho. As células mauthner são delineadas por linhas tracejadas na larva. O cabo óptico (branco) é mostrado posicionado sobre o corpo da célula do neurônio RB.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent