Optogétique du poisson zèbre : Activation du neurone somatosensory génétiquement modifié pour étudier les réponses comportementales larvaires

Overview

Cette vidéo décrit les techniques optogénétiques en activant les neurones somatosensoriels génétiquement modifiés et en enregistrant la réponse comportementale obtenue avec une caméra vidéo à grande vitesse.

Protocol

1. Larves de mont pour des expériences de comportement

1. Faire fondre 1,5% en ddH2O et les conserver dans un bloc thermique de 42 °C pour l’empêcher de se solidifier.
2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférer l’une des larves présélectionnées dans un tube de 1,5 % d’agarose de fonte faible avec le moins d’eau bleue/embryon possible.
3. Transférer les larves dans une goutte d’agarose sur une petite boîte de Pétri.
4. Sous un microscope disséquant, placez la larve dorsale vers le haut.
5. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, couper l’agarose à l’aide d’une fine lame de rasoir (#11 scalpel), laissant un coin d’agar autour de toute la larve.
6. Faire deux coupes diagonales de chaque côté du jaune; prendre soin de ne pas entailler la larve.
7. Remplissez la zone entourant l’agarose d’embryons ou d’eau bleue.
8. Tirez à l’écart du tronc et de la queue de la larve (Figure 1).

2 . Préparer un logiciel de caméra et d’imagerie à grande vitesse

1. Montez une caméra à grande vitesse sur la portée de dissécation.
2. Connectez la caméra à l’ordinateur.
3. Allumez l’ordinateur.
4. Allumez la caméra à grande vitesse.
5. Ouvrir un logiciel de vidéo/imagerie (Nous utilisons un logiciel d’imagerie AOS et nous décrions les procédures pour l’utiliser ici, mais d’autres logiciels d’imagerie sont tout aussi acceptables).
6. Ajustez les paramètres de la caméra enconséquence (c.-à-d. 1 000 images par seconde (fps), 50 % de tampon de déclenchement ou d’autres paramètres préférés).
7. Commencez à enregistrer.

3. Activez les neurones simples à l’aide d’un laser de 473 nm

1. Fixez le stimulateur, le laser et le câble optique.
2. Allumez le stimulateur.
3. Réglez le stimulateur à un maximum de 5 Volts et une durée d’impulsion de 5 msec.
4. Allumez le laser selon les instructions du fabricant.
5. Utilisez un microscope disséquant pour positionner la pointe du câble optique près du corps cellulaire d’un neurone avec l’expression ChEF-tdTomato (Figure 1).
6. Pulsez la lumière bleue pour activer le neurone sensoriel.
7. Enregistrer le comportement à l’aide d’une caméra à grande vitesse réglée à 500 ou 1000 images par seconde.
8. Répétez l’expérience comme vous le souhaitez, en attendant 1 min entre chaque activation pour éviter l’accoutumance. (Nous en enrions un minimum de trois réponses pour chaque neurone).
9. Pour libérer les larves, se détacher agarose avec des forceps, en prenant soin de ne pas blesser l’animal. Cet animal peut être autorisé à se développer davantage et la procédure peut être répétée à un stade plus ancien pour caractériser le développement du comportement. L’embryon peut également être remonté pour l’imagerie confocale à haute résolution de la cellule activée pour corréler le comportement avec la structure cellulaire, tel que décrit ci-dessous.
10. Transférer la larve dans une plaque de culture avec de l’eau bleue/embryon fraîche. Nous utilisons une plaque de 24 puits pour garder une trace des larves individuelles.

Representative Results

Figure 1. Diagramme d’une larve montée de poisson zèbre et de neurones représentatifs impliqués dans la réponse larvaire de contact. Les larves de poisson zèbre ont été partiellement montées dans une agarose à faible fonte de 1,5 % (représentée par des lignes pointillées entourant la partie rostrale de la larve). Un neurone trigeminal (dans la tête) et un neurone Rohon-Beard (dans le tronc) sont représentés en rouge. Les cellules de Mauthner sont décrites par des lignes pointillées dans la larve. Le câble optique (blanc) est montré positionné au-dessus du corps de cellule de neurone rb.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent