وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.
انتقال الإلكترون المجهر (تيم) مفيد للغاية لتصور دبقية صغيرة ، المقصورات oligodendrocytic التحت خلوية ، نجمي ، والعصبية (تغصن والعمود الفقري شجيري ، المحور ، محور عصبي عضال ، حوائط النواة) ، وكذلك على الخلايا والعضيات الهيكل الخلوي ، في الجهاز العصبي المركزي في ارتفاع القرار المكانية. جنبا إلى جنب مع تيم ، قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية يسمح للتمييز من العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية (على سبيل المثال ، دبقية perikarya والعمليات ، وعند استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة Iba1 (الكالسيوم المتأينة الجزيء محول ملزمة 1 ؛ كما عرضت هنا)) ، وتحديد محتويات العصبي من العناصر الخلوية (مثل هرمون السيروتونين) ، وتوطين هذه التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء زمنيا (على سبيل المثال ، 5 ومستقبلات HT1A EphA4). هنا ، نحن تصف بروتوكول للنضح transcardiac من الفئران مع تثبيتي الأكرولين وإزالتها وsectioning من الدماغ ، فضلا عن immunoperoxidase – diaminobenzidine تلطيخ (DAB) ، التضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning للأقسام الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد لفحص مع تيم. عندما أجريت بدقة ، وهذا الأسلوب يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical.
هنا قد وصفنا على بروتوكول لإعداد الماوس لأنسجة المخ immunoelectron المجهري الذي يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical ، عندما يتم تنفيذها بدقة الإجراءات.
جنبا إلى جنب مع تيم ، وهذه الطريقة تمكن من التمييز بين ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر شاو مينغ وليو هاريس Gelbard ألف لاستخدام مضخة تمعجية وvibratome ، وكذلك كارين L. بنتلي وغايل شنايدر في مرفق مجهر إلكترون الأساسية للبحوث التابع لجامعة روتشستر المركز الطبي لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، بوروز صندوق ويلكوم ، وألفريد سلون P. المؤسسة لبأنقرة. M.-È.T. وتمول من قبل دي فون LA RECHERCHE EN كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
*Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
*Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.