Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi
Summary
Vi beskriver ett protokoll för transcardiac perfusion av möss, demontering och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Transmissionselektronmikroskop (TEM) är mycket användbar för att visualisera microglial, oligodendrocytic, astrocytic och neuronala subcellulära fack (Dendrite, dendritiska ryggrad, axonet, axonet terminal, perikaryon), samt deras intracellulära organeller och cytoskelettet, i det centrala nervsystemet vid hög rumslig upplösning. I kombination med TEM, kan pre-inbäddning immuncytokemi diskriminering av cellulära element med några särdrag och kriterier legitimation (t.ex. microglial perikarya och processer, när du använder en antikropp mot mikroglia-specifik markör Iba1 (joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1, som presenteras här)), identifiera signalsubstansen innehållet av cellulära element (t.ex. serotonerga) och deras ultrastrukturella lokalisering av lösliga och membranbundna proteiner (t.ex. 5 HT1A och EphA4 receptorer). Här beskriver vi ett protokoll för transcardiac perfusion av möss med Akrolein fixativ, borttagning och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik-Diaminobenzidin (DAB) färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med TEM. När rigoröst utföras, ger denna teknik en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt.
Protocol
Discussion
Här har vi beskrivit ett protokoll för förberedelser av mus hjärnvävnad för immunoelectron mikroskopi som ger en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt, när de förfaranden som rigoröst utförs.
I kombination med TEM, möjliggör denna metod för att skilja cellulära element med några särdrag och kriterier identifiering. I synnerhet möjliggör immunofluorescensteknik-DAB färgning av Iba1 att identifiera microglial perikarya …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shao-Ming Lu och Harris A. Gelbard för användning av ett peristaltiska pumpar och vibratome samt Karen L. Bentley och Gayle Schneider på ett elektronmikroskop Forskning Core Facility vid University of Rochester Medical Center för tekniskt stöd. Detta arbete har finansierats genom anslag från NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund och Alfred P. Sloan Foundation för AKM. M.-È.T. finansieras av en Fonds de la recherche en Santé du Québec (FRSQ) postdoktoral utbildning utmärkelse.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
