Summary

Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Published: July 20, 2010
doi:

Summary

Vi beskriver ett protokoll för transcardiac perfusion av möss, demontering och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

Transmissionselektronmikroskop (TEM) är mycket användbar för att visualisera microglial, oligodendrocytic, astrocytic och neuronala subcellulära fack (Dendrite, dendritiska ryggrad, axonet, axonet terminal, perikaryon), samt deras intracellulära organeller och cytoskelettet, i det centrala nervsystemet vid hög rumslig upplösning. I kombination med TEM, kan pre-inbäddning immuncytokemi diskriminering av cellulära element med några särdrag och kriterier legitimation (t.ex. microglial perikarya och processer, när du använder en antikropp mot mikroglia-specifik markör Iba1 (joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1, som presenteras här)), identifiera signalsubstansen innehållet av cellulära element (t.ex. serotonerga) och deras ultrastrukturella lokalisering av lösliga och membranbundna proteiner (t.ex. 5 HT1A och EphA4 receptorer). Här beskriver vi ett protokoll för transcardiac perfusion av möss med Akrolein fixativ, borttagning och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik-Diaminobenzidin (DAB) färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med TEM. När rigoröst utföras, ger denna teknik en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt.

Protocol

1. Animal perfusion På dagen innan perfusion, förbereda: – 2 L fosfatbuffert (PB, 100 mm, pH 7,4) och 1 l av natriumfosfat-saltlösning (PBS, 0,9% NaCl i 50 mm PB, pH 7,4) i dubbeldestillerat vatten. Förvara PBS och 1L av PB vid 4 ° C. Dessa kommer att användas för perfusion och pre-inbäddning immuncytokemi. – 1L på 4,0% paraformaldehyd (PFA, pH 7,4) fixativ lösning som gör det möjligt att genomblödningen i 6 möss. För detta ändamål, hetta upp 1 L i PB I ett dragskåp. Väg 40 g …

Discussion

Här har vi beskrivit ett protokoll för förberedelser av mus hjärnvävnad för immunoelectron mikroskopi som ger en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt, när de förfaranden som rigoröst utförs.

I kombination med TEM, möjliggör denna metod för att skilja cellulära element med några särdrag och kriterier identifiering. I synnerhet möjliggör immunofluorescensteknik-DAB färgning av Iba1 att identifiera microglial perikarya …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Shao-Ming Lu och Harris A. Gelbard för användning av ett peristaltiska pumpar och vibratome samt Karen L. Bentley och Gayle Schneider på ett elektronmikroskop Forskning Core Facility vid University of Rochester Medical Center för tekniskt stöd. Detta arbete har finansierats genom anslag från NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund och Alfred P. Sloan Foundation för AKM. M.-È.T. finansieras av en Fonds de la recherche en Santé du Québec (FRSQ) postdoktoral utbildning utmärkelse.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sodium pentobarbital (Nembutal)   Ovation Pharmaceuticals    
Filter paper 315 24 cm   VWR 28331-081  
*Acrolein purum (≥95%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 01680  
Sodium borohydride (≥98%)   Sigma-Aldrich (Aldrich) 452173  
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)   Sigma-Aldrich 441244  
Normal goat serum   Jackson ImmunoResearch 005-000-121  
Rabbit anti-Iba1 primary antibody   Wako 019-19741 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific   Jackson ImmunoResearch 111-066-046 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin   Jackson ImmunoResearch 016-030-084 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution   Electron Microscopy Sciences 19150 Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 82325  
Polypropylene disposable beakers (50 mL)   Fisher 01-291-10  
Aluminium weigh dishes (70 mm)   Fisher NC9261784  
Durcupan epoxy resin   Electron Microscopy Sciences 14040  
Embedding mold   Electron Microscopy Sciences 70907  
DPX mountant for histology   Sigma-Aldrich (BioChemika) 44581  
Gelatin subbed slides   VWR 100241-864  
ACLAR embedding films (7.8 mm)   Electron Microscopy Sciences 50425  
Capsule mold   Electron microscopy Sciences 70150  
High-performance super glue   Corporate Express LOC30379  
Perfect loop for ultra thin sections   Electron Microscopy Sciences 70944  
Superfrost slides   Fisher 22-178-277  
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)   Diatome    
Gelatin from cold water fish skin (~45%)   Sigma-Aldrich (Sigma) G7765  

*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.

Play Video

Cite This Article
Tremblay, M., Riad, M., Majewska, A. Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e2021, doi:10.3791/2021 (2010).

View Video