Overview
סרטון זה מתאר שיטה ליצירת מדיום מותנה איברים הנגזר מכבד העכבר. מערכת מודל זו יכולה לשמש כדי לזהות וללמוד גורמים מסיסים שמקורם באיברים ואת השפעתם על טרופיזם האיברים והתנהגות גרורתית של תאים סרטניים.
Protocol
1. דור של מדיה ממוזגת ריאות ומוח
- במכסה המנוע של תרבות הרקמה הסטרילית, הפוך צינורות PBS המכילים ריאות או מוח שלוש פעמים כדי להסיר שאריות דם מאיברים ולשואב PBS המכיל דם. יש לחזור על הפעולה עם PBS קר ורענן עד שהפתרון נראה ברור ללא עדות לדם.
- מניחים את הריאות והמוח במנות פטרי זכוכית נפרדות של 60 מ"מ2. באמצעות שני להבי אזמל סטריליים, ריאות בשר טחון או מוחות על ידי חתך שוב ושוב קדימה ואחורה עד שברי רקמה הם כ ~ 1 מ"מ3 בגודל.
- קבע את כמות המדיה הדרושה לשימוש חוזר שברי רקמות מהפרש המשקל המחושב.
שים לב: רקמת הריאה והמוח מנורמלים על ידי ההשעיה מחדש ביחס 4:1 מדיה:רקמה (vol/wt). - רסיסי רקמה resuspend בנפח המתאים (נקבע בעבר בשלב 1.3) של בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM):F12 מדיה בתוספת 1x מרוכז תוסף מיטוגן ופניצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר)/ סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
- הוסיפו רסיסי ריאה או רקמת מוח לשימוש חוזר לבאר אחת של צלחת של 6 בארות.
- דגירה שברי רקמה במדיה במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. לאחר הדגירה, לאסוף מדיה מותנית עבור כל רקמה עוד לדלל עוד יותר על ידי הוספת שלושה כמויות שוות ערך של מדיה טרייה בצינור חרוט 50 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במדיה מותנית מדוללת עבור כל איבר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת רקמה גדולה. לאסוף מדיה supernatant ולסנן באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- מדיה מותנית בבריכה מכל איבר(כלומרריאה עם ריאה ומוח עם מוח) מעכברים מרובים כדי להסביר את השונות בין עכבר לעכבר. Aliquot ולאחסן מדיה מותנית ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
