Overview
このビデオでは、マウスの肝臓に由来する臓器のコンディショニング培地を生成する方法について説明します。このモデルシステムは、臓器由来の可溶性因子と、がん細胞の臓器のトロピズムおよび転移性行動への影響を同定し、研究するために使用することができる。
Protocol
1. 肺および脳調べ培地の生成
- 生殖不能組織培養フードにおいて、肺または脳を含むPBS管を3回反転させ、血液を含む臓器および吸引PBSから残留血液を除去する。血液の証拠が明らかになるまで新鮮な冷たいPBSで繰り返します。
- 別々の60 mm2ガラスのシャーレに肺と脳を置きます。2つの無菌メスの刃を使用して、組織断片がおよそ〜1mm3の大きさになるまで繰り返し前後にスライスすることによって肺または脳をミンチする。
- 計算された重量差から組織断片を再懸濁するのに必要な培地の量を決定する。
注: 肺と脳組織は、4:1培地:組織比(vol/wt)で再懸濁によって正規化された体重である。 - Dulbeccoの修飾鷲の媒体(DMEM)の適切な容積(ステップ1.3で以前に決定された)の組織断片を再懸濁する:F12培地は1x濃縮マイトゲンサプリメントおよびペニシリン(50 μg/ml)/ストレプトマイシン(50 μg/ml)を添加した。
- 6ウェルプレートの1つの井戸に再懸濁された肺または脳組織断片を追加します。
- 37°Cおよび5%CO2で24時間培地中の組織断片をインキュベートする。インキュベーションに続いて、各組織の調整された培地を収集し、50 mlの円錐状のチューブに3つの同等の量の新鮮な培地を加えることによってさらに希釈する。
- 4°Cで各臓器の1,000xgの遠心分離機を15分間、大きな組織の破片を除去する。0.22 μmのシリンジフィルターを介して、メディア上清とフィルターを収集します。
- 各器官(すなわち、肺と脳を有する肺)から、複数のマウスから、マウスからマウスへの変動を説明するコンディショションされた培地をプールする。アリコートおよび保存は使用まで-80 °Cで調整された培地である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
