Overview
Bu videoda, fare karaciğerinden türetilen organ şartlandırılmış bir ortam oluşturma yöntemi açıklanmaktadır. Bu model sistem, organdan türetilmiş çözünür faktörleri ve bunların kanser hücrelerinin organ tropikliği ve metastatik davranışları üzerindeki etkilerini tanımlamak ve incelemek için kullanılabilir.
Protocol
1. Akciğer ve Beyin Şartlı Medyanın Üretimi
- Steril bir doku kültürü kaputunda, organlardaki artık kanı çıkarmak ve kan içeren PBS'yi aspire etmek için akciğer veya beyin içeren PBS tüplerini üç kez ters çevirin. Kan kanıtı olmadan çözelti net görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın.
- Akciğerleri ve beyinleri ayrı 60 mm2 cam petri kabına yerleştirin. İki steril neşter bıçağı, kıyma akciğerleri veya beyin kullanarak, doku parçaları yaklaşık ~ 1 mm3 büyüklüğünde olana kadar ileri geri tekrar dilimlenerek.
- Hesaplanan ağırlık farklılığındaki doku parçalarını yeniden harcamak için gereken ortam miktarını belirleyin.
NOT: Akciğer ve beyin dokusu 4:1 ortam:doku oranında (vol/wt) resüspenzyon ile normalleştirilen ağırlıktır. - Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nın (DMEM) uygun hacimde (daha önce 1.3. adımda belirlenen) doku parçalarını yeniden kullanır:F12 ortamı, 1x konsantre mitojen takviyesi ve penisilin (50 μg/ml)/streptomisin (50 μg/ml) ile desteklenir.
- 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna yeniden tanımlanmış akciğer veya beyin dokusu parçaları ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat boyunca medyada doku parçalarını kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, her doku için şartlandırılmış ortam toplayın ve 50 ml konik bir tüpe üç eşdeğer hacimde taze ortam ekleyerek daha da seyreltin.
- Büyük doku kalıntılarını gidermek için 15 dakika boyunca 4 °C'de her organ için seyreltilmiş şartlandırılmış ortamda 1.000 x g'da santrifüj. Ortam süpernatantını toplayın ve 0,22 μm şırındi filtresinden filtreleyin.
- Fareden fareye değişkenliği hesaba katmak için her organdan(yaniakciğerli akciğer ve beyinli beyin) birden fazla fareden havuz şartlandırılmış ortam. Aliquot ve kullanıma kadar -80 °C'de koşullandırılmış medya saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
