Overview
Denna video beskriver en metod för att generera ett organ konditionerat medium härrör från mus levern. Detta modellsystem kan användas för att identifiera och studera organbaserade lösliga faktorer och deras effekter på cancercellernas organtropism och metastaserande beteende.
Protocol
1. Generering av lung- och hjärnbetingade medier
- I en steril vävnadskulturhuv, invertera PBS-rör som innehåller lungor eller hjärna tre gånger för att avlägsna kvarvarande blod från organ och aspirera PBS som innehåller blod. Upprepa med färsk kall PBS tills lösningen verkar klar utan tecken på blod.
- Placera lungor och hjärnor i separata 60 mm2 glas petriskålar. Använd två sterila skalpellblad, köttfärslungor eller hjärnor genom att upprepade gånger skära fram och tillbaka tills vävnadsfragmenten är ungefär ~ 1 mm3 stora.
- Bestäm hur mycket media som behövs för att återanvända vävnadsfragment från den beräknade viktskillnaden.
OBS: Lung- och hjärnvävnad normaliseras genom återupplivning i ett 4:1 media:vävnadsförhållande (vol/wt). - Återanvända vävnadsfragment i lämplig volym (som tidigare fastställts i steg 1.3) av Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM):F12-medier kompletterade med 1x koncentrerat mitogentillskott och penicillin (50 μg/ml)/streptomycin (50 μg/ml).
- Tillsätt återanvända lung- eller hjärnvävnadsfragment till en brunn på en 6-brunnsplatta.
- Inkubera vävnadsfragment i media i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Efter inkubation, samla konditionerade medier för varje vävnad och späd ytterligare genom att tillsätta tre motsvarande volymer färska medier i ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera vid 1 000 x g i utspädda konditionerade medier för varje organ vid 4 °C i 15 minuter för att avlägsna stora vävnadsrester. Samla in media supernatant och filtrera genom ett 0,22 μm sprutfilter.
- Pool konditionerade medier från varje organ (dvs. lungamed lunga och hjärna med hjärna) från flera möss för att ta hänsyn till mus-till-mus variabilitet. Alikvot och lagra konditionerade medier vid -80 °C tills de används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
