Overview
يصف هذا الفيديو طريقة لتوليد جهاز مشروط المتوسطة المستمدة من كبد الماوس. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتحديد ودراسة العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الأعضاء وآثارها على تروبية الأعضاء والسلوك النقيلي للخلايا السرطانية.
Protocol
1. جيل من الرئة والدماغ - وسائل الإعلام مكيفة
- في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة العقيمة، عكس أنابيب PBS التي تحتوي على الرئة أو الدماغ ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقية من الأعضاء وتنشق برنامج تلفزيوني يحتوي على الدم. كرر مع برنامج تلفزيوني بارد جديد حتى يبدو الحل واضحا مع عدم وجود دليل على وجود الدم.
- ضع الرئتين والأدمغة في أطباق بيتري زجاجية منفصلة مقاس 60 مم2. باستخدام اثنين من شفرات المشرط العقيمة، والرئتين المفروم أو العقول عن طريق تشريح مرارا وتكرارا ذهابا وإيابا حتى شظايا الأنسجة هي تقريبا ~ 1 mm3 في الحجم.
- تحديد كمية الوسائط اللازمة لإعادة إنفاق شظايا الأنسجة من فرق الوزن المحسوب.
ملاحظة: يتم تطبيع أنسجة الرئة والدماغ عن طريق إعادة الإنفاق في 4:1 وسائل الإعلام: نسبة الأنسجة (vol/wt). - شظايا الأنسجة Resuspend في الحجم المناسب (المحددة سابقا في الخطوة 1.3) من دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM): F12 وسائل الإعلام تكملها مع 1x الملحق ميتوجين المركزة والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / العقدية (50 ميكروغرام / مل).
- أضف شظايا الرئة أو أنسجة الدماغ التي أعيد إنفاقها إلى بئر واحد من لوحة من 6 آبار.
- احتضان شظايا الأنسجة في وسائل الإعلام لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد الحضانة، وجمع وسائل الإعلام مشروطة لكل الأنسجة ومزيد من التخفيف عن طريق إضافة ثلاثة أحجام مكافئة من وسائل الإعلام الطازجة في أنبوب مخروطي 50 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 1000 x g في وسائط مكيفة مخففة لكل عضو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة حطام الأنسجة الكبيرة. جمع وسائل الإعلام supernatant ومرشح من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- تجمع وسائط مكيفة من كل جهاز(أيالرئة مع الرئة والدماغ مع الدماغ) من الفئران متعددة لحساب تقلب الماوس إلى الماوس. Aliquot وتخزين وسائل الإعلام مشروطة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
