Overview
Cette vidéo décrit une méthode de génération d’un organe conditionné milieu dérivé du foie de souris. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et étudier les facteurs solubles dérivés des organes et leurs effets sur le tropisme organique et le comportement métastatique des cellules cancéreuses.
Protocol
1. Génération de médias conditionnés par les poumons et le cerveau
- Dans une hotte stérile de culture tissulaire, inverser les tubes PBS contenant des poumons ou du cerveau à trois reprises pour enlever le sang résiduel des organes et aspirer PBS contenant du sang. Répétez avec du PBS froid frais jusqu’à ce que la solution semble claire sans aucune preuve de sang.
- Placer les poumons et le cerveau dans des boîtes de Pétri en verre séparées de 60 mm2. À l’aide de deux lames stériles de scalpel, hacher les poumons ou le cerveau en coupant à plusieurs reprises d’avant en arrière jusqu’à ce que les fragments de tissu soient d’environ ~ 1 mm3 de taille.
- Déterminer la quantité de médias nécessaires pour resuspendre les fragments de tissu à partir de la différence de poids calculée.
REMARQUE: Le tissu pulmonaire et cérébral est le poids normalisé par la résuspension dans un rapport média:tissulaire 4:1 (vol/wt). - Resuspendez des fragments de tissu dans le volume approprié (déterminé précédemment dans l’étape 1.3) du milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM):F12 médias complétés avec 1x supplément concentré de mitogène et pénicilline (50 μg/ml)/streptomycine (50 μg/ml).
- Ajouter des fragments de tissus pulmonaires ou cérébraux résuspendus à un puits d’une plaque de 6 puits.
- Incuber les fragments de tissu dans les médias pendant 24 heures à 37 °C et 5 % de CO2. Après l’incubation, recueillir les supports conditionnés pour chaque tissu et diluer davantage en ajoutant trois volumes équivalents de médias frais dans un tube conique de 50 ml.
- Centrifugeuse à 1 000 x g dans des supports conditionnés dilués pour chaque organe à 4 °C pendant 15 min pour enlever les gros débris tissulaires. Recueillir le supernatant multimédia et filtrer à travers un filtre à seringues de 0,22 μm.
- Mettre en commun les supports conditionnés de chaque organe(c.-à-d.les poumons avec le poumon et le cerveau avec le cerveau) de plusieurs souris pour tenir compte de la variabilité de la souris à la souris. Aliquot et stocker les supports conditionnés à -80 °C jusqu’à utilisation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
