Overview
Dieses Video beschreibt eine Methode zur Erzeugung eines organkonditionierten Mediums, das von der Mausleber abgeleitet wurde. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um organisch abgeleitete lösliche Faktoren und ihre Auswirkungen auf den Organtropismus und das metastasierende Verhalten von Krebszellen zu identifizieren und zu untersuchen.
Protocol
1. Erzeugung von Lungen- und Hirn-Konditionierten Medien
- In einer sterilen Gewebekulturhaube, invertieren PBS-Röhren mit Lunge oder Gehirn dreimal, um Restblut aus Den Organen zu entfernen und PBS enthaltend zu saugen. Wiederholen Sie dies mit frischer kälter PBS, bis die Lösung klar und ohne Blutnachweis erscheint.
- Lunge und Gehirn in separate 60 mm2 Glaspetrischalen geben. Verwendung von zwei sterilen Skalpellklingen, Hackfleischlungen oder Gehirnen durch wiederholtes Hin- und Herschneiden, bis Gewebefragmente etwa 1 mm3 groß sind.
- Bestimmen Sie die Menge an Medien, die zum Aufsetzen von Gewebefragmenten aus der berechneten Gewichtsdifferenz benötigt wird.
HINWEIS: Lungen- und Hirngewebe werden durch Resuspension in einem 4:1 Medien:Gewebe-Verhältnis (vol/wt) normalisiert. - Resuspend Gewebefragmente in entsprechendem Volumen (vorher in Schritt 1.3 bestimmt) von Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM):F12 Medien ergänzt mit 1x konzentriertem Mitogen-Ergänzung und Penicillin (50 g/ml)/Streptomycin (50 g/ml).
- Fügen Sie resuspendierte Lungen- oder Hirngewebefragmente zu einem Brunnen einer 6-Well-Platte hinzu.
- Inkubieren Sie Gewebefragmente in Medien für 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2. Nach der Inkubation konditionierte Medien für jedes Gewebe sammeln und weiter verdünnen, indem sie drei äquivalente Mengen an frischen Medien in einem 50 ml konischen Rohr hinzufügen.
- Zentrifuge bei 1.000 x g in verdünnten konditionierten Medien für jedes Organ bei 4 °C für 15 min, um große Gewebeablagerungen zu entfernen. Sammeln Sie Medienüberstand und filtern Sie durch einen 0,22 m Spritzenfilter.
- Pool konditionierte Medien aus jedem Organ(d.h.Lunge mit Lunge und Gehirn mit Gehirn) von mehreren Mäusen, um die Variabilität von Maus zu Maus zu berücksichtigen. Aliquot und speichern Sie konditionierte Medien bei -80 °C bis zum Gebrauch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
