Meio Condicionado a Órgãos: Gerando Meio a partir de células de órgãos colhidos para estudos de câncer metastático

Overview

Este vídeo descreve um método de geração de um órgão condicionado médio derivado do fígado do rato. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos sobre o tropismo de órgãos e comportamento metastático das células cancerosas.

Protocol

1. Geração de Mídia Condicionada pulmonar e cerebral

1. Em uma capa de cultura tecidual estéril, inverta tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover sangue residual de órgãos e aspirar PBS contendo sangue. Repita com pbs frio fresco até que a solução pareça clara sem evidência de sangue.
2. Coloque pulmões e cérebros em placas de petri de vidro separadas de 60 mm2. Usando duas lâminas estéreis de bisturi, pulmões picados ou cérebros cortando repetidamente para frente e para trás até que fragmentos de tecido sejam aproximadamente ~ 1 mm3 de tamanho.
3. Determine a quantidade de mídia necessária para resususpend fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculada.
   NOTA: O tecido pulmonar e cerebral são normalizados por resuspensão em uma media 4:1:razão de tecido (vol/wt).
4. Fragmentos de tecido resuspend em volume apropriado (determinado anteriormente na etapa 1.3) do Médio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco:mídia F12 suplementada com suplemento mitogênio concentrado de 1x e penicilina (50 μg/ml)/streptomicina (50 μg/ml).
5. Adicione fragmentos de tecido pulmonar ou cerebral resuspended a um poço de uma placa de 6 poços.
6. Incubar fragmentos de tecido em mídia por 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Após a incubação, colete mídia condicionada para cada tecido e dilua ainda mais adicionando três volumes equivalentes de mídia fresca em um tubo cônico de 50 ml.
7. Centrífuga a 1.000 x g em mídia condicionada diluída para cada órgão a 4 °C por 15 min para remover grandes detritos teciduais. Colete a mídia supernante e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
8. A piscina conditabilizava a mídia de cada órgão (ou seja,pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) de vários camundongos para explicar a variabilidade de rato para rato. Aliquot e armazenar mídia condicionada a -80 °C até usar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile