Overview
Это видео описывает метод генерации органа условных среды, полученных из печени мыши. Эта модельная система может быть использована для выявления и изучения органных растворимых факторов и их влияния на тропизм органов и метастатическое поведение раковых клеток.
Protocol
1. Поколение легких и мозг-условных средств массовой информации
- В стерильной ткани культуры капюшон, инвертировать PBS трубки, содержащие легких или мозга в три раза, чтобы удалить остаточную кровь из органов и аспират PBS, содержащий кровь. Повторите со свежим холодным PBS, пока решение не появится ясным без каких-либо признаков крови.
- Поместите легкие и мозги в отдельные 60 мм2 стеклянные чашки Петри. Используя два стерильных лезвия скальпеля, фарш легких или мозгов, неоднократно нарезки взад и вперед, пока фрагменты ткани примерно 1 мм3 в размерах.
- Определите количество средств массовой информации, необходимых для повторного перерасхода фрагментов тканей от расчетной разницы в весе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие и ткани мозга нормализуются путем повторного успенения в соотношении 4:1 media:tissue (vol/wt). - Фрагменты ткани Resuspend в соответствующем объеме (определяется ранее в шаге 1.3) Модифицированного орла Dulbecco's Medium (DMEM):F12 media дополнены 1x концентрированной добавкой митогена и пенициллином (50 мкг/мл)/стрептомицином (50 мкг/мл).
- Добавьте повторно спенсированные фрагменты легочной или мозговой ткани к одному колодец пластины из 6 колодец.
- Инкубировать фрагменты тканей в средствах массовой информации в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. После инкубации, собирать кондиционированные средства массовой информации для каждой ткани и дальнейшего разбавления, добавив три эквивалентных тома свежих средств массовой информации в 50 мл конической трубки.
- Центрифуга при 1000 х г в разбавленных кондиционированных средствах массовой информации для каждого органа при 4 градусов по Цельсию в течение 15 минут для удаления крупных обломков тканей. Соберите супернатант мультимедиа и процберите через фильтр шприца 0,22 мкм.
- Бассейн кондиционированных средств массовой информации из каждогооргана (т.е.легких с легкими и мозга с мозгом) от нескольких мышей для учета мыши к мыши изменчивости. Aliquot и хранить кондиционированные средства массовой информации при -80 градусов по Цельсию до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
