Overview
यह वीडियो माउस लिवर से प्राप्त अंग वातानुकूलित माध्यम पैदा करने की एक विधि का वर्णन करता है। इस मॉडल प्रणाली का उपयोग अंग-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों और कैंसर कोशिकाओं के अंग ट्रोपिज्म और मेटास्टैटिक व्यवहार पर उनके प्रभावों की पहचान और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
1. फेफड़ों और मस्तिष्क वातानुकूलित मीडिया की पीढ़ी
- एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में, अंगों से अवशिष्ट रक्त को हटाने और रक्त युक्त पीबीएस को aspirate करने के लिए तीन बार फेफड़ों या मस्तिष्क युक्त PBS ट्यूबों को उलटा। ताजा ठंड PBS के साथ दोहराएं जब तक समाधान रक्त का कोई सबूत के साथ स्पष्ट प्रतीत होता है ।
- फेफड़ों और दिमाग को अलग-अलग 60 एमएम2 ग्लास पेट्री डिश में रखें। दो बाँझ स्केलपेल ब्लेड, कीमा फेफड़ों या दिमाग का उपयोग करके बार-बार आगे और पीछे टुकड़ा करने की क्रिया जब तक ऊतक के टुकड़े आकार में लगभग ~ 1 mm3 हैं।
- गणना वजन अंतर से ऊतक के टुकड़े को फिर से खर्च करने के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा निर्धारित करें।
नोट: फेफड़े और मस्तिष्क के ऊतकों को 4:1 मीडिया में पुनः पेंशन द्वारा सामान्यीकृत वजन: ऊतक अनुपात (vol/wt) हैं। - दुल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के उचित मात्रा (पहले चरण 1.3 में निर्धारित) में ऊतक के टुकड़ों को फिर से उठाया गया: F12 मीडिया 1x केंद्रित मिटोजेन पूरक और पेनिसिलिन (50 माइक्रोन/एमएल) /स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 μg/ml) के साथ पूरक है।
- एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से करने के लिए पुनः निलंबित फेफड़ों या मस्तिष्क के ऊतकों के टुकड़े जोड़ें ।
- मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 24 घंटे के लिए ऊतक के टुकड़े इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ऊतक के लिए वातानुकूलित मीडिया इकट्ठा करें और 50 मिलीलीटर शंकु नली में ताजा मीडिया के तीन समकक्ष संस्करणों को जोड़कर आगे पतला करें।
- बड़े ऊतक मलबे को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक अंग के लिए पतला वातानुकूलित मीडिया में 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। मीडिया सुपरनेट और एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर ले लीजिए।
- माउस-टू-माउस परिवर्तनशीलता के लिए खाते में कई चूहों से प्रत्येक अंग(यानी, फेफड़ों और मस्तिष्क के साथ फेफड़े) से पूल वातानुकूलित मीडिया। अलीकोट और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर वातानुकूलित मीडिया स्टोर करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
