Medio acondicionado de órganos: Generación de medios a partir de células de órganos cosechadas para estudios de cáncer metastásico

Overview

Este video describe un método de generación de un medio acondicionado de órgano derivado del hígado del ratón. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y estudiar factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el tropismo de órganos y el comportamiento metastásico de las células cancerosas.

Protocol

1. Generación de medios condicionados por pulmón y cerebro

1. En una capucha de cultivo de tejido estéril, invierta tubos PBS que contengan pulmón o cerebro tres veces para extraer sangre residual de los órganos y aspirar PBS que contenga sangre. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución parezca clara sin evidencia de sangre.
2. Coloque los pulmones y el cerebro en placas de petri de vidrio separadas de 60 mm2. Uso de dos cuchillas estériles del bisturí, pulmones de mince o cerebro cortando repetidamente hacia adelante y hacia atrás hasta que los fragmentos de tejido son aproximadamente ~ 1 mm3 de tamaño.
3. Determine la cantidad de medios necesarios para resuspend fragmentos de tejido a partir de la diferencia de peso calculada.
   NOTA: Los pulmones y el tejido cerebral se normalizan por resuspensión en un medio de 4:1: relación entre los tejidos (vol/wt).
4. Fragmentos de tejido resuspend en el volumen adecuado (determinado anteriormente en el paso 1.3) del Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco:Medios F12 complementados con suplemento mitogeno concentrado 1x y penicilina (50 μg/ml)/estreptomicina (50 μg/ml).
5. Agregue fragmentos de tejido pulmonar o cerebral resuspendidos a un pozo de una placa de 6 pozos.
6. Incubar fragmentos de tejido en medios durante 24 horas a 37 °C y 5% CO2. Después de la incubación, recoja los medios acondicionados para cada tejido y diluya aún más añadiendo tres volúmenes equivalentes de medios frescos en un tubo cónico de 50 ml.
7. Centrífuga a 1.000 x g en medios acondicionados diluidos para cada órgano a 4 °C durante 15 minutos para eliminar los desechos de tejido grandes. Recopile el sobrenadante de medios y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
8. Pool condicionó los medios de cada órgano(es decir,pulmón con pulmón y cerebro con cerebro) de varios ratones para tener en cuenta la variabilidad del ratón al ratón. Aliquot y almacenar medios acondicionados a -80 °C hasta su uso.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile