Overview
Questo video descrive un metodo per generare un mezzo condizionato da organo derivato dal fegato del topo. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.
Protocol
1. Generazione di supporti condizionati al polmone e al cervello
- In una cappa sterile di coltura tissutale, invertire tre volte i tubi PBS contenenti polmone o cervello per rimuovere il sangue residuo dagli organi e aspirare PBS contenente sangue. Ripetere con PBS fresco freddo fino a quando la soluzione appare chiara senza prove di sangue.
- Posizionare polmoni e cervelli in piastre di petri di vetro separate da 60 mm2. Utilizzando due lame sterili di bisturi, polmoni tritare o cervelli tagliando ripetutamente avanti e indietro fino a quando i frammenti di tessuto sono di circa ~ 1 mm3 di dimensioni.
- Determinare la quantità di mezzi necessari per rimorsi di frammenti di tessuto dalla differenza di peso calcolata.
NOTA: Il tessuto polmonare e cerebrale è un peso normalizzato dalla resopensione in un rapporto media:tessuto 4:1 (vol/wt). - Frammenti di tessuto resuspend in volume appropriato (determinati in precedenza nella fase 1.3) del mezzo dell'aquila modificata (DMEM) di Dulbecco:mezzo F12 integrato con 1x integratore di mitogeno concentrato e penicillina (50 μg/ml)/streptomicina (50 μg/ml).
- Aggiungere frammenti di polmone o tessuto cerebrale rimostrati a un pozzo di una piastra di 6 po '.
- Incubare frammenti di tessuto nei mezzi per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, raccogliere i mezzi condizionati per ciascun tessuto e diluire ulteriormente aggiungendo tre volumi equivalenti di mezzi freschi in un tubo conico da 50 ml.
- Centrifuga a 1.000 x g in mezzi condizionati diluiti per ogni organo a 4 °C per 15 minuti per rimuovere grandi detriti tissutali. Raccogliere il supernatante multimediale e filtrare attraverso un filtro siringa da 0,22 μm.
- Mezzi condizionati in piscina da ogni organo(cioè polmone con polmone ecervello con cervello) da più topi per tenere conto della variabilità tra topo e topo. Aliquota e conservare i supporti condizionati a -80 °C fino all'uso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
