Overview
Denne videoen beskriver en metode for å generere et organkondisjonert medium avledet fra muselever. Dette modellsystemet kan brukes til å identifisere og studere organ-avledede løselige faktorer og deres effekter på organtropismen og metastatisk oppførsel av kreftceller.
Protocol
1. Generering av lunge- og hjernekondisjonerte medier
- I en steril vevskultur hette, invertere PBS rør som inneholder lunge eller hjerne tre ganger for å fjerne gjenværende blod fra organer og aspirere PBS som inneholder blod. Gjenta med frisk kald PBS til løsningen vises klar uten tegn på blod.
- Plasser lunger og hjerner i separate 60 mm2 glass petri retter. Bruk to sterile skalpellblader, hakk lunger eller hjerner ved å kutte frem og tilbake gjentatte ganger til vevsfragmenter er omtrent ~ 1 mm3 i størrelse.
- Bestem mengden medier som trengs for å resuspendere vevsfragmenter fra den beregnede vektforskjellen.
MERK: Lunge- og hjernevev er vekt normalisert ved resuspension i et 4:1 media:vevsforhold (vol/wt). - Resuspend vev fragmenter i passende volum (bestemt tidligere i trinn 1.3) av Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM):F12 medier supplert med 1x konsentrert mitogen supplement og penicillin (50 μg/ml)/streptomycin (50 μg/ml).
- Tilsett resuspended lunge- eller hjernevevsfragmenter til en brønn av en 6-brønns plate.
- Inkuber vevsfragmenter i media i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter inkubasjon samler du betingede medier for hvert vev og fortynner ytterligere ved å legge til tre tilsvarende mengder friske medier i et 50 ml konisk rør.
- Sentrifuge ved 1000 x g i fortynnede betingede medier for hvert organ ved 4 °C i 15 minutter for å fjerne store vevsrester. Samle medium supernatant og filtrer gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.
- Bassengkondisjonerte medier fra hvert organ (dvs.lunge med lunge og hjerne med hjerne) fra flere mus for å ta hensyn til muse-til-mus-variasjon. Aliquot og lagre betingede medier ved -80 °C til bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
