Summary
في مقايسة سياليداز هو نهج بسيط التقنية التي من شأنها توضيح الآلية الجزيئية رواية (ق) من أجهزة الاستشعار من العدوى الميكروبية TLR والمشاركة في الأمراض الالتهابية على مستوى المستقبلات على سطح الخلية الحية الضامة.
Abstract
الثدييات مثل مستقبلات تول (TLRs) هي عائلة من المستقبلات التي تعترف الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئية. لا يقتصر الأمر على أجهزة استشعار TLRs الحاسم الجرثومية (مثل الفيروسات والبكتيريا والطفيليات) التهابات ، وأنها تلعب أيضا دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المعدية ، والأمراض الالتهابية ، وربما في أمراض المناعة الذاتية. وبالتالي ، يجب أن تكون شدة ومدة ردود TLR ضد الأمراض المعدية لرقابة مشددة. ويترتب على ذلك فهم السلامة الهيكلية للاستشعار مستقبلات ، والتفاعلات يجند ومكوناتها يشير أمر ضروري لحماية مناعية لاحقة. كما أنه سيوفر فرصا هامة لتعديل المرض من خلال التلاعب الاستشعار. على الرغم من أن تتميز كذلك مسارات إشارات من أجهزة الاستشعار TLR ، المعلمات السيطرة على التفاعلات بين أجهزة الاستشعار ويغاندس التي ما زالت تبقى محددة بشكل واضح. حددنا مؤخرا آلية جديدة لتفعيل TLR التي يجند لها الطبيعية ، التي لم وحظ سابقا 1،2. فإنه يشير إلى أن يجند لرقابة مشددة من صنع TLR التنشيط من خلال تفعيل سياليداز Neu1. وذكرت أيضا أن علينا Neu1 ينظم بإحكام مثل مستقبلات neurotrophin TrkA وTrkB 3 ، والتي تنطوي Neu1 ومصفوفة الفلزي - 9 (MMP - 9) عبر الحديث في مجمع مع المستقبلات 4. وقد تم استخدام مقايسة سياليداز البداية لايجاد يجند رواية ، thymoquinone ، في تفعيل Neu4 سياليداز على سطح الخلية الضامة ، والخلايا الجذعية ، والخلايا الليفية عبر البروتينات Gαi النوع من الاختزال و 5 MMP - 9. لمستقبلات TLR ، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن Neu1 سياليداز بالفعل في مجمع مع مستقبلات TLR - 2 ، -3 -4 و، والتي يسببها بناء يجند ملزم لمستقبلات سواء. تنشيط hydrolyzes سياليداز Neu1 sialyl α ،3 - 2 - β مرتبطة galactosyl المخلفات بعيدة عن يجند ملزم لإزالة عوائق الفراغية لdimerization TLR - 4 ، MyD88/TLR4 التوظيف المعقدة ، والاستجابات NFkB تنشيط الخلايا الموالية للالتهابات. في تقرير التعاونية ، وقد تبين Neu1 سياليداز لتنظيم خلايا البلاعم في البلعمة 6. أخذت معا ، وفرت لنا مقايسة سياليداز مع رؤى قوية لتفعيل الآليات الجزيئية التي يسببها مستقبلات يجند. على الرغم من أن العلاقة الدقيقة بين Neu1 سياليداز وتفعيل TLR ، تورك مستقبلات لم يتم بعد توضيح بشكل كامل ، فإنه يمثل نهجا جديدا أو رائدة لتنظيم مسارات الخلية.
Protocol
1. إحياء خلايا البلاعم مجمدة
- قبل إحياء الخلايا المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية ، واحد يحتاج إلى إعداد مستنبت باستخدام العقيمة التي تمت تصفيتها Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) و 5 ميكروغرام / مل من plasmocin. Plasmocin هو الحل للمضادات الحيوية المستخدمة في بحثنا للقضاء على التلوث ومنع ميكوبلازما الثقافات الخلية.
- قنينة واحدة من الخلايا المجمدة ، واحد يضيف 4 مل ، 1 مل من الوسط المثقف إلى 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة في غطاء الاحتواء بيولوجية معقمة.
- عندما تؤخذ في قارورة من الخلايا المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية ، وسرعان ما تحسنت عن الاحترار يد في هود العقيمة ، والذي يستغرق حوالي 2-3 دقائق.
- حالما يتم إذابة الخلايا ، يتم نقلها بسرعة إلى أنها تحتوي على القارورة المتوسطة مشروطة باستخدام ماصة 1mL العقيمة.
- توضع القارورة التي تحتوي على خلايا الأنسجة في حاضنة الثقافة على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- فحص الخلايا للنمو والالتزام على أساس يومي حتى تصبح 75 ٪ إلى 90 ٪ متموجة باستخدام مجهر مقلوب.
- خلال الخلية الحضانة والثقافة ، ويتم تعقيم 12 مم الشرائح الزجاجية الدائرية من خلال تغطية لهم في الايثانول 70 ٪ في طبق بتري زجاجي كبير لمدة 1 ساعة في الحكومة لاحتواء المخاطر البيولوجية ، وبعد ذلك تتم إزالة الكحول وتخزينها لreusage ، وعلى جانبي الزجاج الرطب وتترك عرضة لتدفق الهواء المعقم ، تمت تصفيتها في مجلس الوزراء تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 24 ساعة أو حتى تجف.
2. طلاء للخلايا الفحص سياليداز
- قبل طلاء الخلايا ، وضعت بعناية واحد عقيم شريحة زجاجية دائرية في بئر واحدة من طراز فالكون 24 دينار بحريني جيدا مسطحة القاع مع غطاء الأنسجة الثقافة وحة البوليسترين المعالجة باستخدام تعقيمها منحني كامل المشتعلة ، 4 "، مسننة ، الفولاذ المقاوم للصدأ forcep لسبب واحد من الخلايا في قارورة التقاء 75 ٪ ، ونحن عادة استخدام 12 بئرا من لوحة الثقافة.
- لخلايا البلاعم ملتصقة ، يتم إزالة المتوسطة DMEM مشروط من القارورة باستخدام ماصة 5 مل العقيمة في مجلس الوزراء الاحتواء العقيمة. غسل الخلايا الملتصقة مرة واحدة مع تريس العقيمة 1X مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة لإزالة أي وسيط والتي تحتوي على مصل ، وإضافة 1 مل من الكالسيوم متوسطة الفوسفات (CMF) مجانا مخزنة المالحة في درجة الحموضة 7.4 درجة تكفي لتغطية الخلايا. وتوضع الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية لحوالي 10 دقيقة أو حتى تبدأ الخلايا ليقلع في القارورة. يمكن القارورة بلطف هزت أو لتخفيف أي اهتزاز الخلايا المتبقية ملتصقة.
- في 1 مل من الخلايا علقت في القارورة ، أضف 3 مل من المتوسط DMEM مكيفة. تأخذ 0.5 مل من الخلايا مع وقف التنفيذ ونقل sterilely منهم إلى لوحة تحتوي على أنسجة مثقف 12 ملم الشرائح الزجاجية الدائرية. تقريبا ، يتم نقل 0.5 × 10 6 الخلايا إلى شرائح زجاجية دائرية.
- يتم تحضين خلايا الأنسجة لوحة الثقافة التي تحتوي على 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 لمدة 24 ساعة من أجل السماح للخلايا على الانضمام إلى شرائح زجاجية دائرية.
3. سياليداز الفحص
1. جعل التحكم
- مكان شريحة المجهر (بلوري : 1 الغاية ، 1slide ، 25 × 75 × 1 ملم) في مجلس الوزراء أو احتواء المختبرات وإضافة عن طريق خلط في ترتيب تسلسلي للمركبات التالية : 1 + 1 ميكرولتر داكو ميكرولتر من MUNANA - 4 وأخيرا + 3 مخزنة ميكرولتر من تريس المالحة 7.4 درجة الحموضة (TBS).
- بعد إزالة وسائل الإعلام من جانب واحدة تحتوي على الخلايا ، ورفع بلطف شريحة زجاجية دائرية مع forcep "4 الى ركنية من البئر. بعناية إزالة الشريحة الزجاجية مع forcep ومكان الشريحة مع الخلايا التي تواجه على الحل الخليط على المجهر الشرائح.
- على الفور ، واتخاذ الشريحة microcope إلى المجهري EPI - الفلورسنت التي تم تعيينها للمرشح للأشعة فوق البنفسجية ، وكاميرا رقمية لالتقاط الصور الفلورسنت.
- تحت المجهر التركيز على النقيض من المرحلة حتى تستطيع أن ترى في الخلايا ومن ثم التبديل إلى وضع الفلورسنت. التقاط صور للخلايا تحت الفلورسنت في 1 دقيقة ، 2 دقيقة ، و3 دقيقة. التقاط صورة واحدة من الخلايا تحت النقيض من المرحلة.
2. جعل الاختبار إيجابية
- بقعة المركبات التالية في ترتيب تسلسلي على شريحة أخرى المجهر : 1 + 1 ميكرولتر داكو ميكرولتر من MUNANA - 4 + 2 ميكرولتر من LPS + 1 ميكرولتر من TBS.
- كرر الخطوات من 3.1.2 إلى 3.1.4 أعلاه.
3. جعل اختبار ايجابي مع مثبطات نورامينيداز تاميفلو
- بقعة المركبات التالية في النظام المتسلسل التالي على شريحة أخرى المجهر : 1μL داكو + 1μL من MUNANA - 4 + 2 ميكرولتر من LPS + 1 ميكرولتر من تاميفلو.
- وتركيزات تاميفلو معدة سلفا في تريس 1X مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة ، وتركيز النهائي للمركبات في اتصال مع الخلايا الحية على شريحة زجاجية دائرية سوف يكون عاملا التخفيف من 5.
- كرر الخطوات من 3.1.2 إلى 3.1.4 أعلاه.
4. يحتاج تحديد تركيز مثبط لمنع 50 ٪ من نشاط سياليداز (IC 50)
- لقياس الفلورسنت التي تحيط الخلايا ، ويتم تحليل الصور باستخدام ImageJ 1.38x مع البرنامج المساعد تحليل لقياس RBG. أخذ القراءات 50 نقطة عشوائية من الخلايا المحيطة مضان وحساب متوسط إجمالي ومضان.
- يتم إنشاء IC 50 من مؤامرة لتركيز مثبط تحويل وحدات السجل (على سبيل المثال ، سجل نانوغرام / مل) على محور س ضد مضان يعني على محور ذ باستخدام الانحدار غير الخطية.
5. أسرار النجاح
- تأكد من الخلايا في الثقافة هي خالية من التلوث ميكوبلازما. نستخدم عادة Plasmocin في مستنبت للسيطرة على ذلك.
- وينبغي استخدام الركيزة الاصطناعي النورامينيداز ، 4 - MUNANA ، أعد حديثا. ويمكن استخدام الركيزة أعد في غضون أسبوع للمقايسة سياليداز.
- إذا كان لديه خط خلية التعبير مستقبلات منخفضة على سطح الخلية ، يمكن للمرء استخدام جرعات أعلى من التحفيز ليجند.
- شهدنا أيضا أن الخلايا passaged لأكثر من 6 مرات قد تفقد مستقبلات على النمط الظاهري. طازجة ، ينبغي أن يبعث مثقف الخلايا.
6. ممثل النتائج
انظر بروتوكول المتحركة للمقايسة مع سياليداز نتائج ممثلة في تولي ملف باوربوينت .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام مقايسة وضعت حديثا للكشف عن النشاط في خلايا البلاعم سياليداز يعيش 2 ، استخدمنا هذه التكنولوجيا للكشف عن النشاط سياليداز في النشاط سياليداز يجند التي يسببها العيش في BMC - 2 خلايا البلاعم بطريقة تعتمد على الجرعة وكذلك في حي DC - 2.4 الخلايا الجذعية ، HEK-TLR4/MD2 ، HEK293 ، والخلايا الثديية SP1 غدية ، WT الإنسان و1140F01 وWG0544 النوع الأول الخلايا الليفية sialidosis. منعت مثبطات نورامينيداز مثل تاميفلو (أوسيلتاميفير فوسفات) thymoquinone التي يسببها النشاط سياليداز في العيش BMC - 2 الخلايا مع ميكرومتر 50 من 0.0194 IC IC مقارنة مع 50 من 19.17 ميكرومتر لمثبطات نورامينيداز دانا (2 - ديوكسي - 2 ،3 - ديهيدرو DN - acetylneuraminic حامض) 5. وأفادت ونحن أيضا أن تطبيقات أخرى مثل أضداد Neu1 ، -2 و 3 محددة ليس لديهم تثبيط نشاط سياليداز TQ التي يسببها العيش في BMC - 2 والبشرية THP - 1 خلايا البلاعم لكن المضادة للNeu4 الأضداد كتلة تماما هذا النشاط. هناك تطبيق لهذا النشاط سياليداز للكشف عن نشاط سياليداز قوية المرتبطة TQ تعامل يعيش نخاع العظم الابتدائي (BM) الخلايا المشتقة من البلاعم كاتيبسين WT وhypomorphic والفئران مع نقص Neu1 الثانوية (NeuI دينار كويتي) ، ولكن ليس من Neu4 خروج المغلوب ( Neu4 KO) 1،2،5 الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، طبقت ذيفان الشاهوق (PTX) ، ومثبط للبروتينات محددة Gαi من مستقبلات البروتين يقترن G - (GPCR) ومجموعة واسعة من مثبطات galardin المصفوفة (MMP) الفلزي وبيبيرازين العيش BMC - 2 ، THP - 1 والابتدائية خلايا البلاعم BM كتلة تماما TQ التي يسببها النشاط سياليداز 5. لا تراعى هذه الآثار المثبطة مع نفس GM1 غانغليوزيد محددة باء الكوليرا السم الوحيدات (CTXB) وكذلك مع CTX ، التيروزين كيناز K252a المانع ، والمانع واسعة النطاق سورامين النوع من الاختزال. المانع محددة من MMP - 9 ، ومكافحة MMP - 9 الضد والضد مكافحة Neu4 ولكن لا مانع معين من النشاط MMP - 3 كتلة تماما سياليداز TQ التي يسببها العيش في THP - 1 الخلايا التي تعبر عن وNeu4 MMP - 9 على 5 سطح الخلية.
أخذت معا ، ويمكن استخدام مقايسة سياليداز لتقديم رؤى قوية لتفعيل الآليات الجزيئية التي يسببها مستقبلات يجند تنطوي sialidases مثل Neu1 Neu4 أو اعتمادا على طبيعة يجند. سرعة النشاط سياليداز يجند من صنع بوساطة مستقبلات يجند محدد يوحي بأن مثل مستقبلات الغليكوزيلاتي TrkA NGF ، TrkB BDNF اتصال والمستقبلات التي تشبه شكل نموذجا يدل على سطح غشاء الخلية الجزيئية التي تنطوي على منصة التنظيمية ليجند متجهة مستقبلات ، Gαi البروتينات ، MMP - 9 و Neu1 أو سياليداز Neu4. مستقبلات يجند كل ملزمة من خلال الحث النشاط سياليداز النوع من الاختزال ، يشير البروتينات عبر الغشاء Gαi وتفعيل MMP - 9. Neu1 أو Neu4 وMMP - 9. عبر الحديث في مجمع مع مستقبلات على سطح الخلية تمكن التنشيط السريع للسياليداز لإزالة حمض السياليك الفراغية عوائق في تكوين الجمعيات في توليد مستقبلات مستقبلات وظيفية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وساهمت SRA PJ على قدم المساواة مع الكتاب الأول.
Acknowledgments
الدعم الجزئي عن طريق المنح لMRS هو من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) ، وهاري Botterell مؤسسة للأبحاث العلوم العصبية ، مركز البحوث الزراعية ، وأبحاث القلب والأوعية الدموية وكيلي غارفيلد صندوق التنمية. SRA هي المستفيدة من جائزة الملكة أبحاث الجامعة وجيه روبرت ويلسون زمالة. PJ هي المستفيدة من جائزة الملكة عليا وجيه روبرت ويلسون زمالة. AG وSA يتلقون جائزة الملكة عليا. وكان سادس المستفيدة من المنح الدراسية العليا في أونتاريو في العلوم والتكنولوجيا (OGSST). AG هو المستفيد من الملكة فرانكلين منحة دراسات عليا السرخس. SA هو المستفيد من الملكة RS منحة دراسات عليا ماكلولين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (Oseltamivir Phosphate) | Hoffmann-La Roche AG |
References
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R. Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase. Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).
- Woronowicz, A. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase. Glycobiology. 17, 10-24 (2007).
- Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling. Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).
- Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9. Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).
- Seyrantepe, V. Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1. Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).
