Upptäckt av Neu1 Sialidase aktivitet i regleringen av Toll-like receptor aktivering

Summary

Den sialidase-analysen är en enkel teknisk metod som kommer att belysa nya molekylära mekanism (er) TLR sensorer av mikrobiella infektioner och engagemang i inflammatoriska sjukdomar på receptornivå på cellytan av levande makrofager.

Abstract

Däggdjur Toll-like receptorer (TLRs) är en familj av receptorer som känner igen patogen-associerade molekylära mönster. Inte bara är TLRs avgörande sensorer av mikrobiell (t.ex. virus, bakterier och parasiter) infektioner, spelar de också en viktig roll i patofysiologin för infektionssjukdomar, inflammatoriska sjukdomar, och eventuellt i autoimmuna sjukdomar. Därför måste intensitet och varaktighet av TLR respons mot infektionssjukdomar bli hårt kontrollerad. Härav följer att förstå den strukturella integriteten av sensor receptorer, deras samspel ligand och signalering komponenter är avgörande för efterföljande immunologiska skydd. Det skulle också ge stora möjligheter för sjukdom förändring genom sensorn manipulation. Även om signalvägar i TLR sensorer är väl definierade, de parametrar som styr samspelet mellan sensorer och deras ligander fortfarande dåligt definierade. Vi har nyligen identifierat en ny mekanism för TLR aktivering av dess naturliga ligand, som inte tidigare har observerats ^1,2. Det tyder på att ligand-inducerad TLR aktivering är hårt kontrollerad av Neu1 sialidase aktivering. Vi har också rapporterat att Neu1 hårt reglerar neurotrophin receptorer som TrkA och TrkB ^3, som innebär Neu1 och matris metalloproteinas-9 (MMP-9) överhörning i komplexa med receptorer ^4. Den sialidase analysen har initialt använda för att hitta en ny ligand, thymoquinone i aktivering av Neu4 sialidase på cellytan av makrofager, dendritiska celler och fibroblaster via GPCR Gαi proteiner och MMP-9 ^5. För TLR-receptorer, våra data tyder på att Neu1 sialidase redan komplex med TLR-2, -3 och -4 receptorer, och är inducerad på ligandbindande till antingen receptorn. Aktivt Neu1 sialidase hydrolyserar sialyl α-2 ,3-kopplade β-galactosyl rester långt från ligandbindande att ta bort steriska hinderance till TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 komplexa rekrytering, NFkB aktivering och pro-inflammatoriska reaktioner cell. I ett samarbetsprojekt rapport har Neu1 sialidase visat att reglera fagocytos i makrofager celler ^6. Sammantaget har sialidase-analysen gett oss kraftfulla insikter till de molekylära mekanismer ligand-inducerad aktivering av receptorn. Även om den exakta relationen mellan Neu1 sialidase och aktivering av TLR har Trk receptorer ännu inte helt klarlagd, skulle det innebära en ny eller banbrytande på vägar cell reglering.

Protocol

1. Återuppväcka Frozen Makrofag celler

1. Innan återuppväcka frusna celler från -80 ° C frys, ett måste förbereda odlingsmedium med steril filtreras Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 5 mikrogram / ml plasmocin. Plasmocin är ett antibiotikum lösning som används i vår forskning att undanröja och förebygga mykoplasma kontaminering av cellkulturer.
2. För en flaska med frusna celler lägger ett 4 ml, 1 ml av den odlade medellång till en 25 cm ² cellodling kolven i en steril biologiskt inneslutning huva.
3. När flaskan med frusna celler tas från -80 ° C frys, de är snabbt tinas upp för hand uppvärmning i den sterila huva, som tar ca 2-3 min.
4. Så snart cellerna tinas de snabbt över till kolven som innehåller betingade mediet med en 1 mL steril pipett.
5. Kolven som innehåller cellerna placeras i en vävnadsodling inkubator vid 37 ° C och 5% CO _2.
6. De celler kontrolleras för tillväxt och anslutning dagligen tills de blir 75% till 90% konfluenta med ett inverterat mikroskop.
7. Under cellodling inkubation, är 12 mm runda glasskivor steriliseras genom att täcka dem i 70% etanol i ett stort glas petriskål för 1 timme i biohazard inneslutning skåpet är alkoholen efteråt bort och lagras för återanvändningen, och den våta sidan glaset finns kvar utsätts för sterila-filtrerad luftflödet i skåpet under en UV i 24 timmar eller tills de är torra.

2. Plätering celler för Sialidase analys

1. Innan plätering av celler, är en steril cirkelformad glasskiva försiktigt placeras i en brunn i en BD Falcon 24-och flat botten med lock vävnad-kulturen behandlas polystyren plattan med en steriliserad flammande fullt böjda, 4 ", sågtandade, rostfritt stål forcep . För en kolv av celler på 75% sammanflödet använder vi oftast 12 brunnar av kulturen plattan.
2. För anhängare macrophage celler är DMEM villkorat mediet avlägsnas från kolven med hjälp av en 5 ml steril pipett i sterila inneslutning skåpet. Tvätta tillhörande cellerna gång med 1x steril Tris koksaltlösning pH 7,4 för att ta bort serum som innehåller medium och tillsätt 1 ml av kalcium-medium fritt (CMF) fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,4 tillräckligt för att täcka cellerna. Cellerna är placerade i 37 ° C inkubator i ca 10 min eller tills de celler börjar lyfta i kolven. Kolven kan lätt vaggas eller skakas för att lossa eventuella kvarvarande anhängare celler.
3. Till 1 ml av svävande celler i kolven, tillsätts 3 ml DMEM betingade medium. Ta 0,5 ml av suspenderade celler och sterilely överfört dem till vävnaden odlade plattan innehåller 12 mm runda glasskivor. Ungefär, är 0,5 x 10 ⁶ celler överförs till runda glasskivor.
4. Vävnaden odlingsplatta innehåller celler inkuberas vid 37 ° C i 5% CO ₂ i 24 timmar för att möjliggöra för cellerna att ansluta sig till den runda glasskivor.

3. Sialidase analys

1. Göra kontroll

1. Placera ett objektglas (frostade: 1 slut, 1slide, 25 x 75 x 1 mm) i inneslutningen skåp eller lab bänk och lägga till genom att blanda i ordningsföljd följande föreningar: 1 mikroliter DAKO + 1 mikroliter av 4-MUNANA och slutligen + 3 mikroliter av Tris koksaltlösning pH 7,4 (TBS).
2. Efter att media från en brunn som innehåller de celler du försiktigt lyfter den cirkulära glasskiva med 4 "forcep till hörnet av brunnen. Försiktigt bort glasskiva med forcep och placera bilden med de celler som vetter mot blandningen lösning på på objektglas.
3. Omedelbart ta microcope bilden till en epi-fluorescerande mikroskopi som har fastställts för UV-filter och har en digital kamera för att fånga den fluorescerande bilder.
4. Fokusera mikroskop i faskontrast tills du kan se cellerna och sedan byta till lysrör läge. Ta bilder av cellerna med fluorescerande vid 1 min, 2 min och 3 min. Ta en enda bild av cellerna i faskontrast.

2. Göra det positiva testet

1. Spot följande föreningar i ordningsföljd på ett annat objektglas: 1 mikroliter DAKO + 1 mikroliter av 4-MUNANA + 2 mikroliter av LPS + 1 mikroliter av TBS.
2. Upprepa steg 3.1.2 till 3.1.4 ovan.

3. Göra det positiva testet tillsammans med Neuraminidasenzymets hämmare Tamiflu

1. Spot följande föreningar i följande ordningsföljd på ett annat objektglas: 1μL DAKO + 1μL av 4-MUNANA + 2 mikroliter av LPS + 1 mikroliter av Tamiflu.
2. Tamiflu koncentrationer är redan förberedda i 1x Tris koksaltlösning pH 7,4, den slutliga koncentrationen av föreningarna i kontakt med levande celler på de runda glasplatta kommer att ha en utspädningsfaktor av 5.
3. Upprepa steg 3.1.2 till 3.1.4 ovan.

4. Fastställande av koncentrationen av Inhibitor krävs för att hämma 50% av Sialidase aktivitet (IC ₅₀₎

1. Att kvantifiera fluorescerande omger cellerna, är bilderna analyseras med ImageJ 1.38x med att analysera plugin för mätning av RBG. Ta 50 slumpmässiga stickprovskontroller läsningar av den fluorescens som omger cellerna och beräkna medelvärdet av den totala fluorescensen.
2. IC ₅₀ genereras från en tomt på inhibitorn koncentrationen omvandlas som log enheter (t.ex. log ng / ml) på x-axeln mot medelvärdet fluorescens på y-axeln med hjälp av icke-linjär regression.

5. Hemligheter till framgång

1. Se till att de celler i kultur föroreningar fria från mykoplasma. Vi använder rutinmässigt Plasmocin i ett odlingsmedium att kontrollera för detta.
2. Den konstgjorda neuraminidas substrat, 4-MUNANA, bör användas nyberedd. Den beredda substrat kan användas inom en vecka för sialidase analysen.
3. Om cellinje har en låg receptor uttryck på cellytan, kan man använda en högre dos av ligand för stimulering.
4. Vi har också upplevt att celler passerats i över 6 gånger kan förlora sina receptorn fenotyp. Färskt ska återuppstå celler odlas.

6. Representativa resultat

Se animerad protokoll för sialidase analysen med representativa resultat i bifogad Powerpoint-fil .

Discussion

Med hjälp av nyutvecklade test för att upptäcka sialidase aktiviteten i levande macrophage celler ² har vi använt denna teknik för att upptäcka sialidase aktivitet i ligand-inducerad sialidase aktiviteten i levande BMC-2 makrofag celler i ett dosberoende sätt samt i levande DC-2.4 dendritiska celler , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 bröst adenocarcinom celler, mänskliga WT och 1140F01 och WG0544 typ I sialidosis fibroblast celler. Neuraminidashämmare som Tamiflu (oseltamivir fosfat) hämmade thymoquinone-induced sialidase aktiviteten i levande BMC-2-celler med en IC ₅₀ på 0,0194 mikroM jämfört med en IC ₅₀ på 19,17 mikroM för neuraminidas-hämmare DANA (2-deoxy-2 ,3-dehydro- DN-acetylneuraminic syra) ^5. Vi har också rapporterat att andra applikationer såsom specifika anti-Neu1, -2 och 3-antikroppar har ingen hämning av TQ-inducerad sialidase aktiviteten i levande BMC-2 och mänskliga THP-1 makrofager celler, men anti-Neu4 antikroppar helt blockera denna verksamhet. Det är en tillämpning av sialidase aktivitet för att upptäcka en kraftig sialidase verksamhet i samband med kvoten behandlade leva primär benmärg (BM) makrofag celler från WT och hypomorphic cathepsin En möss med en sekundär Neu1 brist (NeuI KD) men inte från Neu4 knockout ( Neu4 KO) möss ^1,2,5. Dessutom tillämpade pertussis toxin (PTX), en specifik hämmare av Gαi proteiner av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och det breda hämmare utbud av matrix metalloproteinas (MMP) galardin och piperazin att leva BMC-2, THP-1 och primära BM macrophage celler blockerar helt TQ-inducerad sialidase aktivitet ^5. Samma hämmande effekter är inte observerats med GM1 ganglioside specifika koleratoxin subenhet B (CTXB) samt med CTX, tyrosinkinashämmare K252a, och det breda utbudet GPCR hämmare suramin. Den specifika hämmare av MMP-9, anti-MMP-9 antikroppar och anti-Neu4 antikroppar men inte specifik hämmare av MMP-3 helt blockera TQ-inducerad sialidase aktiviteten i levande THP-1 celler som uttrycker Neu4 och MMP-9 på cellytan ^5.

Sammantaget kan sialidase analysen användas för att ge kraftfulla insikter till de molekylära mekanismer ligand-inducerad aktivering av receptorn med sialidases som Neu1 eller Neu4 beroende på vilken typ av liganden. Den snabbhet med vilken ligand-inducerad sialidase aktiviteten medieras av ligand-bundna receptorn tyder på att glykosylerat receptorer som NGF TrkA, BDNF TrkB och Toll-like receptorer bildar ett signalsystem paradigm på cellytan membran med en molekylär organisatorisk plattform av ligand-bundet receptorn , Gαi proteiner, MMP-9 och Neu1 eller Neu4 sialidase. Ligandbindande respektive receptorer leder sialidase verksamhet genom GPCR-signalering via membran Gαi proteiner och MMP-9 aktivering. Neu1 eller Neu4 och MMP-9 överhörning i komplexa med receptor på cellens yta möjliggör en snabb aktivering av sialidase att ta bort sialinsyra-steriska hinderance till receptorn förening gäller att skapa en fungerande receptor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG