Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

Summary

El ensayo sialidasa es un enfoque simple técnica que dilucidar nuevo mecanismo molecular (s) de los sensores de TLR de las infecciones microbianas y la participación en las enfermedades inflamatorias a nivel del receptor en la superficie celular de los macrófagos en vivo.

Abstract

Mamíferos receptores Toll-like (TLR) son una familia de receptores que reconocen patógenos patrones moleculares asociados. No sólo son los TLR sensores crucial de microorganismos (por ejemplo, virus, bacterias y parásitos), las infecciones, sino que también desempeñan un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y, posiblemente, en las enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, la intensidad y la duración de las respuestas TLR contra las enfermedades infecciosas deben ser estrictamente controlados. De ello se desprende que la comprensión de la integridad estructural de los receptores de sensor, sus interacciones ligando y componentes de señalización es esencial para la protección inmunológica posterior. También se ofrecen importantes oportunidades para la modificación de la enfermedad a través de la manipulación del sensor. Aunque las vías de señalización de TLR sensores están bien caracterizados, los parámetros que controlan las interacciones entre los sensores y sus ligandos todavía siguen estando mal definidas. Recientemente hemos identificado un nuevo mecanismo de activación de TLR con su ligando natural, que no ha sido observado previamente ^1,2. Se sugiere que la activación inducida por ligandos TLR está estrechamente controlada por la activación de sialidasa Neu1. También se ha informado de que Neu1 bien regula los receptores de neurotrofinas como TrkA y TrkB ^3, que implican Neu1 y metaloproteinasas de matriz-9 (MMP-9) cross-talk en el complejo con los receptores ^4. El ensayo ha sido inicialmente sialidasa utilizar para encontrar un nuevo ligando timoquinona, en la activación de Neu4 sialidasa en la superficie celular de los macrófagos, células dendríticas y células de fibroblastos a través de proteínas GPCR Gαi y ^{5 de} MMP-9. Para los receptores TLR, nuestros datos indican que Neu1 sialidasa ya está en el complejo con los receptores TLR-2, -3 y -4, y se induce a ligando vinculante a cualquier receptor. Activado Neu1 hidroliza sialidasa sialil α-2 ,3-β-ligado galactosil residuos lejos de unión del ligando a quitar impedimento estérico de TLR-4 dimerización, MyD88/TLR4 contratación complejos, la activación de NFkB y pro-inflamatorias respuestas de las células. En un informe de colaboración, sialidasa Neu1 se ha demostrado que regulan la fagocitosis de macrófagos ^6. En conjunto, el ensayo sialidasa nos ha proporcionado ideas de gran alcance de los mecanismos moleculares de la activación del receptor inducida por ligandos. Aunque la relación precisa entre Neu1 sialidasa y la activación de TLR, los receptores Trk aún no se ha aclarado completamente, ya que implicaría un nuevo enfoque o pionero de las vías de regulación celular.

Protocol

1. La resurrección de las células congeladas del macrófago

1. Antes de la resurrección de las células congeladas del congelador -80 ° C, hay que preparar el medio de cultivo utilizando filtrado estéril Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con fetal al 10% de suero bovino (FBS) y 5 mg / ml de plasmocin. Plasmocin es una solución de antibiótico que se utiliza en nuestra investigación para eliminar y prevenir la contaminación por micoplasmas en cultivos celulares.
2. Para un vial de células congeladas, se añade 4 ml, 1 ml de medio de cultivo a 25 cm ² frasco de cultivo celular en una campana de contención de riesgos biológicos estériles.
3. Cuando el vial de células congeladas se han tomado de los -80 ° C congelador, se descongelan rápidamente calentando la mano en la campana estéril, que tarda unos 2-3 minutos.
4. Tan pronto como las células se descongelan, que se transfieren rápidamente en el frasco que contiene el medio condicionado con una pipeta estéril de 1 ml.
5. El frasco que contiene las células se colocan en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.
6. Las células comprobado para el crecimiento y la adhesión a diario hasta que se conviertan en 75% al ​​90% confluente utilizando un microscopio invertido.
7. Durante la incubación de cultivo celular, 12 diapositivas mm circular de cristal se esterilizan por cubrir en un 70% de etanol en un vaso grande placa de Petri durante 1 hora en el gabinete de contención de riesgos biológicos, el alcohol es posteriormente retirado y almacenado para la reutilización, y los lados de vidrio mojado quedan expuestos al flujo de aire estéril, filtrada en el armario debajo de un UV durante 24 horas o hasta que se sequen.

2. Las células Revestimiento para el ensayo de sialidasa

1. De las placas, las células, una sola diapositiva de vidrio estériles circular se colocan cuidadosamente en un pocillo de una BD Falcon de 24 pocillos de fondo plano con tapa de la placa de cultivo de tejidos tratados de poliestireno con una curva completa esterilizada de fuego, 4 ", serrado, pinza de acero inoxidable . Para un frasco de células en un 75% de confluencia, por lo general utilizan 12 pozos de la placa de cultivo.
2. Para los macrófagos adherentes, el medio DMEM acondicionado se retira del frasco utilizando una pipeta de 5 ml estéril en el gabinete de contención estéril. Lavar las células adheridas, una vez con 1x estéril tamponada de Tris pH 7,4 salina para eliminar cualquier tipo de soporte de suero que contiene, y agregar 1 ml de medio libre de calcio (CMF) tampón fosfato salino a pH 7,4 para cubrir las células. Las células se colocan en la incubadora a 37 ° C durante unos 10 minutos o hasta que las células comienzan a despegar en el frasco. El matraz se mecía suavemente o sacudida para aflojar las células adherentes restantes.
3. A la de 1 ml de células en suspensión en el matraz, añadir 3 ml de medio DMEM acondicionado. Tomar 0,5 ml de las células en suspensión y estéril que transfiere a la placa de cultivo de tejidos que contienen los 12 mm diapositivas circular de vidrio. Aproximadamente, 0,5 x 10 ⁶ células se transfieren a las diapositivas de cristal circular.
4. Las células de cultivo de tejidos placa que contiene se incuban a 37 ° C en 5% CO ₂ durante 24 horas a fin de permitir que las células se adhieran a los portaobjetos de vidrio circular.

3. Sialidasa ensayo

1. Haciendo que el control

1. Colocar un portaobjetos de microscopio (helado: 1 final, 1Deslice, 25 x 75 x 1 mm) en el gabinete de contención o de mesa de laboratorio y añadir, mezclando en el orden secuencial de los siguientes compuestos: 1 l Dako + 1 L de 4-Muñana y, por último, + 3 l de solución salina tamponada de Tris pH 7,4 (TBS).
2. Después de la eliminación de los medios de comunicación de un pozo que contiene las células, levante suavemente el portaobjetos de vidrio circular con 4 "pinza a la esquina del pozo. Retire con cuidado el portaobjetos de vidrio con la pinza y colocar la placa con las células que dan a la solución de la mezcla de el portaobjetos del microscopio.
3. Inmediatamente, toma la diapositiva microcope a un microscopio epi-fluorescente que se ha fijado para el filtro de los rayos UV y tiene una cámara digital para capturar las imágenes fluorescentes.
4. Enfocar el microscopio de contraste de fase bajo hasta que pueda ver las células y luego cambiar al modo de fluorescentes. Tome fotos de las células bajo lámparas fluorescentes en 1 min, 2 y 3 minutos. Tomar una sola foto de las células bajo contraste de fase.

2. Hacer la prueba positiva

1. Lugar los siguientes compuestos en el orden secuencial en otro portaobjetos: 1 l Dako + 1 L de 4-Muñana + 2 l de LPS + 1 l de TBS.
2. Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.4.

3. Hacer la prueba positiva, junto con inhibidores de la neuraminidasa Tamiflu

1. Lugar de los compuestos siguientes en el orden siguiente secuencia en otro portaobjetos: 1μL Dako + 1μL de 4-Muñana + 2 l de LPS + 1 l de Tamiflu.
2. Las concentraciones de Tamiflu son pre-preparados en 1x Tris buffer de pH 7,4 salina, la concentración final de los compuestos en contacto con las células vivas en el portaobjetos de vidrio circular tendrá un factor de dilución de 5.
3. Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.4.

4. Determinación de la concentración del inhibidor necesaria para inhibir el 50% de la actividad sialidasa (IC ₅₀₎

1. Para cuantificar el fluorescente que rodea las células, las imágenes se analizaron con ImageJ 1.38x con el plugin de análisis para medir la RBG. Tomar 50 lecturas de azar de la fluorescencia que rodea las células y se calcula la media de la fluorescencia total.
2. El IC ₅₀ se genera a partir de una parcela de la concentración del inhibidor convertido como unidades de registro (por ejemplo, registro ng / mL) en el eje X en contra de la media de fluorescencia en el eje y el uso de regresión no lineal.

5. Secretos para el Éxito

1. Asegúrese de que las células en cultivo son libres de contaminación por micoplasma. Nosotros usamos Plasmocin en un medio de cultivo para el control de este.
2. El sustrato artificial de la neuraminidasa, 4-Muñana, se debe utilizar recién preparada. El sustrato preparado se puede utilizar dentro de una semana para el ensayo de sialidasa.
3. Si la línea celular tiene una baja expresión del receptor en la superficie celular, se puede utilizar una dosis más alta del ligando para la estimulación.
4. También hemos experimentado que las células de pasajes por más de 6 veces puede perder su fenotipo del receptor. Recientemente, las células deben ser cultivadas resucitado.

6. Resultados representante

Véase el protocolo de animación de la prueba de sialidasa con resultados representativos en el documento adjunto archivo Powerpoint .

Discussion

Utilizando el ensayo de nuevo desarrollo para detectar la actividad sialidasa en los macrófagos en vivo ^2, se utilizó esta tecnología para detectar la actividad sialidasa en la actividad sialidasa inducida por ligandos en vivo BMC-2 en células de los macrófagos en forma dosis dependiente, así como en vivo DC-2.4 células dendríticas , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 células de adenocarcinoma de mama, WT humanos y 1140F01 y WG0544 células de tipo I de fibroblastos sialidosis. Inhibidores de la neuraminidasa como el Tamiflu (oseltamivir fosfato) inhibe timoquinona inducida por la actividad sialidasa en vivo BMC-2 células con una CI ₅₀ de 0.0194 M en comparación con una CI ₅₀ de 19,17 M de inhibidor de la neuraminidasa DANA (2-desoxi-2 ,3-dehidro- DN-acetil-ácido) ^5. También hemos informado de que otras aplicaciones tales como los anticuerpos específicos anti-Neu1, -2 y 3 no tienen inhibición de la actividad sialidasa TQ-inducida en vivo BMC-2 y humanos THP-1 macrófagos, pero anti-Neu4 anticuerpos bloquean completamente esta actividad. No es una aplicación de la actividad sialidasa para detectar una actividad sialidasa vigoroso asociado con TQ tratado de médula ósea en vivo primaria (BM), los macrófagos derivados de la catepsina WT y hypomorphic A los ratones con una deficiencia secundaria Neu1 (NeuI KD), pero no de Neu4 knockout ( Neu4 KO) ratones ^1,2,5. Además, la toxina pertussis (PTX), un inhibidor específico de proteínas Gαi de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y los inhibidores de la amplia gama de metaloproteinasas de matriz (MMP) y piperazina galardin aplicada a vivir BMC-2, THP-1 y primaria BM células macrófagos bloquear completamente TQ-inducida por la actividad sialidasa ^5. Estos efectos inhibitorios mismo no se observan con el gangliósido GM1 B específicas de cólera subunidad de toxina (ctxB), así como con CTX, tirosina quinasa K252a, y la amplia gama de GPCR inhibidor de la suramina. El inhibidor específico de la MMP-9, anti-MMP-9 de anticuerpos y de anticuerpos anti-Neu4 pero no el inhibidor específico de la MMP-3 por completo la actividad sialidasa bloque TQ-inducida en vivo células THP-1 que expresan Neu4 y MMP-9 en el superficie de las células ^5.

En conjunto, el ensayo sialidasa se puede utilizar para proporcionar información de gran alcance para los mecanismos moleculares de la activación inducida por ligandos del receptor de la participación sialidasas como Neu1 o Neu4 dependiendo de la naturaleza del ligando. La rapidez de la actividad sialidasa inducida por ligandos mediada por el receptor del ligando obligado sugiere que los receptores glicosilada como NGF TrkA, TrkB BDNF y los receptores Toll-like formar un paradigma de señalización en la membrana de la superficie celular implican una plataforma molecular de organización del ligando del receptor de obligado , Gαi proteínas, MMP-9 y Neu1 o sialidasa Neu4. Ligando respectivos receptores de unión induce la actividad sialidasa a través de GPCR de señalización a través de proteínas de la membrana y la activación Gαi MMP-9. Neu1 o Neu4 y MMP-9 cross-talk en el complejo con el receptor en la superficie celular permite una rápida activación de la sialidasa para eliminar ácido siálico estérico impedimento a la asociación de los receptores en la generación de un receptor funcional.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG